كلونينگ و بيان ژن VP3 ويروس بيماري بورس عفوني در اشرشيا كولي و تخليص پروتئين VP3 نوتركيب

Cloning and Expression of VP3 Gene of Infectious Bursal Disease Virus in E. coli and Purification of the Recombinant Protein

بيماري بورس عفوني يا گامبورو ، يكي از بيماري­هاي ويروسي بسيار واگير طيور است كه در صنعت طيور در سراسر جهان باعث زيان­هاي اقتصادي مي­شود. از آنجاييكه كه پس از عفونت با ويروس بيماري بورس عفوني (IBDV) اولين آنتي­بادي­ها بر ضد پروتئين ساختماني VP3 توليد مي­شوند، اين پروتئين آنتي ژن مناسبي براي استفاده در اليزا ميباشد. باتوجه به دشوار بودن تهيه VP3 طبيعي از IBDV يا سلول هاي آلوده به ويروس، VP3 نوتركيب بيان شده در اشرشياكولي مي تواند آنتي­ژن مطلوبي براي اين منظور محسوب شود. مطالعه حاضر با هدف كلونينگ ژنVP3 سويه ويروس واكسن D78 در پلاسميد pMal-C2X (يك پلاسميد بياني پروكاريوتي) و بيان و خالص سازي پروتئين نوتركيب انجام گرديد. بنابر اين ژن VP3 با آزمايش RT-PCR تكثير داده شده و پس از هضم با آنزيم هاي محدودگر مناسب در پلاسميد pMal-C2X كلون گرديد. پس از تعيين توالي و اطمينان از كلونينگ موفق اين ژن، بيان پروتئين نوتركيب با آزمايش SDS-PAGE تاييد گرديد. در ادامه پروتئين نوتركيب با استفاده از ستون كروماتوگرافي حاوي رزين آميلوز خالص ­شد. بررسي واكنش پروتئين VP3 نوتركيب در آزمايش ايمونوبلاتينگ نشان داد كه پروتئين توليد شده از نظر آنتي ژني فعال مي باشد. با توجه به راندمان بالاي توليد در اين سيستم، پروتئين بيان شده كانديداي مناسبي براي طراحي آزمايش اليزا و سنجش تيتر آنتي بادي عليه ويروس بيماري بورس عفوني مي باشد.

Infectious bursal disease or Gumboro, is a highly contagious viral disease of poultry which causes economic losses in the poultry industry, worldwide. Following infection, the first antibodies are produced against the structural VP3 protein of the Infectious bursal disease virus (IBDV); therefore, VP3 is a suitable antigen for use in ELISA. Given the difficulty of purifying native VP3 from IBDV or virus-infected cells, recombinant VP3 expressed in E. coli can be considered for this purpose. This study was performed with the aim of cloning the VP3 gene of D78 vaccine strain of the virus in pMal-C2X plasmid (a prokaryotic expression plasmid) and the expression and purification of the recombinant protein. Thus, VP3 gene was amplified by RT-PCR and cloned in plasmid pMal-C2X, after digestion with appropriate restriction enzymes. After sequencing to ensure the successful cloning of the gene, the expression of recombinant protein was confirmed by SDS-PAGE. In the following, the recombinant protein was purified using amylose resin chromatography column. Evaluation of the recombinant VP3 protein in immunoblotting showed that the produced protein was antigenically active. Considering the high efficiency of protein production in this system, the expressed protein is a good candidate for the design of ELISA to measure antibody titers against infectious bursal disease virus (IBDV).