كاربرد طرح مركب مركزي چرخش پذير به منظور بهينه سازي توليد آنزيم آلكالين پروتئاز خارج سلولي توسط سويه جداسازي شده جديد باسيلوس پسودوفيرموس MSB4

Application of Rotatable Central Composite Design for Optimization of Extracellular Alkaline Protease Production from newly isolated Bacillus pseudofirmus MSB4

مقدمه: پروتئازهاي قليايي خارج سلولي با منشا ميكروبي، يكي از مهم‌ترين آنزيم‌هاي صنعتي بوده كه كاربردهاي فراوان در صنايع مختلف دارند. در اين مطالعه، توليد پروتئاز قليايي باكتري باسيلوس پسودوفيرموس MSB4 با استفاده از روش‌شناسي سطح پاسخ افزايش يافت. مواد و روش‏‏ها: چهار متغير مستقل موثر، بر اساس نتايج به دست آمده از روش تك عاملي (غلظت زايلوز، غلظت عصاره گوشت، pH و دماي انكوباسيون)، به منظور تجزيه و تحليل الگوي پاسخ و ساخت مدل با استفاده از روش طرح مركب مركزي چرخش پذير انتخاب شدند. طراحي آزمايش، شامل 30 آزمايش داراي 4 تكرار در نقطه مركزي مي شد و هر متغير در 5 سطح مختلف بررسي شد. به علاوه حضور ژن‌هاي پروتئازهاي قليايي خارج سلولي در سويه MSB4 با استفاده از PCR ارزيابي شد. نتايج: حداكثر مقدار توليد آنزيم (U/ml 397/185) كه حدود 2/2 برابر بيشتر از روش تك عاملي و 7/3 برابر بيشتر از شرايط غير بهينه است، بر طبق نتايج طرح مركب مركزي چرخش پذير با استفاده از 3 درصد عصاره گوشت، اسيديته 9 و دماي 37 درجه سانتي‌گراد به دست آمد. همچنين ژن هاي sub I, II و apr با سايز مورد انتظار (به ترتيب با 319، 486 و 194 زوج باز)  مسؤول متالوپروتئاز و سرين پروتئاز قليايي خارج سلولي در سويه MSB4 با استفاده از PCR تشخيص داده شدند. بحث و نتيجه‏گيري: نتايج آزمايشگاهي به خوبي با مدل به دست آمده سازگاري دارند (9982/0 Adj R2:) و اين مدل توانايي زيادي براي پيش بيني متغير پاسخ براي مشاهدات جديد خواهد داشت (9967/0Pred R2: ). نتايج اين مطالعه نشان داد كه روش تك عاملي و سطح پاسخ به ترتيب روش مفيدي براي غربال‌گري و بهينه‌سازي توليد پروتئاز در سويه MSB4 بودند

Introduction: Microbial extracellularalkaline proteases are one of the most important industrial enzymes with a wide range of applications in various industries. In the present study, the production of an alkaline protease by Bacillus pseudofirmus MSB4 was evaluated using response surface methodology (RSM). Materials and methods: Four significant independent variables were selected, based on the results of onefactoratatime (OFAT) approach (xylose concentration, beef extract concentration, pH and temperature), for rotatable central composite design (RCCD) to analyze the response pattern and to establish a model. The design consisted of total 30 runs, at five levels for each factor, with four replications of the center points. In addition, the presence of extracellular alkaline protease genes was evaluated by using PCR. Results: Maximum protease production (185.397 U/ml), 2.2 times higher than that of OFAT method and 3.7 times higher than the unoptimized conditions, was obtained by using 3% w/v beef extract, at pH 9 and 37ºC according to the results of RCCD. Furthermore, the genes sub I, II and apr with the expected size (319, 486 and 194 bp, respectively) corresponding to the extracellular alkaline serine protease and metalloprotease were detected in MSB4 by using PCR. Discussion and conclusion: The experimental data well fitted the model (Adj R2: 0.9982) and the established quadratic model has a great ability to predict responses for new observations (Pred R2: 0.9967). The results showed that the OFAT and RSM strategies were a useful screening and optimization method for enhancing protease production of MSB4, respectively.