افزايش بيان ژن دفنسين (Rs-AFP1) با منشا گياه تربچه (Raphanus sativus) در گياه كلزا (Brassica napus) به منظور ارتقا مقاومت نسبت به بيماري پوسيدگي اسكلروتينيايي ساقه

Overexpression of radish ( Raphanus sativus ) defensin gene ( Rs - AFP1 ) in canola ( Brassica napus ) improves resistance to Sclerotinia stem rot disease

پوسيدگي اسكلروتينيايي ساقه با عامل بيماري Sclerotinia sclerotiorum يكي از بيماري هاي مهم قارچي كلزا (Brassica napus) محسوب مي شود. كاربرد روش هاي مهندسي ژنتيك از طريق افزايش بيان ژن هاي مفيد در گياه، مي تواند نويد بخش جايگزيني براي روش هاي كنترل شيميايي باشد. دفنسين ها، پپتيدهاي ضد ميكروبي هستند كه با نفوذپذيركردن غشاي سلول مهاجم، باعث از بين رفتن آن ها مي شوند و مي توانند كانديد مناسبي جهت تراريختي باشند. در اين تحقيق، ژن دفنسين (Rs-AFP1) با منشا گياه تربچه (Raphanus sativus) در وكتور بياني pBI121 تحت پروموتور CaMV35S همسانه سازي شد. سازه نوتركيب حاصل (pBINZP1) از طريق تراريختي با آگروباكتريوم به گياه كلزا منتقل شد. گياهان ترايخت نسل T0 توسط واكنش زنجيره اي پلي مراز و آزمون سادرن بلات تائيد شدند. نرخ تراريختي 4/2 درصد به دست آمد و تعداد نسخه هاي تراژن در ژنوم گياهان تراريخت بين يك الي سه متغير بود. فعاليت ضد قارچي گياهان تراريخت تك نسخه در نسلT0 و گياهان تراريخت هموزيگوت در نسل T2 به ترتيب توسط آزمون هاي زيست سنجي درون شيشه اي و آزمون گلخانه اي بررسي شدند. نتايج نشان داد كه بيان ژن دفنسين در كلزاي تراريخت، باعث ارتقا مقاومت در برابر اين قارچ بيمارگر نسبت به گياهان غير تراريخت شده است.

Sclerotinia stem rot caused by Sclerotinia sclerotiorum is one of the major fungal diseases in canola (Brassica napus). Using new genetic engineering methods to target useful genes transition in plants can promise substitution of chemical control methods. Defensins are antimicrobial peptides which cause permeabilization of fungal membranes, leading to the inhibition of fungal growth and can be an appropriate candidate for transformation. In this study, a radish (Raphanus sativus) defensin gene (Rs-AFP1) from was cloned to pBI121expression vector under CaMV35S promoter. The recombinant construct (pBINZP1) was transferred to canola through Agrobacterium-mediated method. Putative transgenic plants of T0 generation were confirmed by polymerase chain reaction and Southern blot analysis. The transformation frequency obtained 4.2% and the copy numbers of integrated transgenes into transgenic plants genome ranged between 1–3 copies. The antifungal activities of single copy transgenic plants in T0 generation and homozygous transgenic plants in T2 generation were studied by In vitro bioassays and greenhouse assay, respectively. The results showed that over expression of defensin in transgenic canola improved resistance to this fungal pathogen compared to untransformed plants.