طراحي RNA دو رشته اي با راندمان بالا براي ايجاد ناقل RNAi امگا گليادين در گندم

Double stranded RNA design with high efficiency for RNAi vector omega gliadin in wheat

فناوري ريبونوكلئيك اسيد مداخله گر (RNAi) به عنوان يك ابزار قدرتمند براي خاموشي بيان ژن هدفگيري شده برپايه تشابه توالي نوكلئوتيدي مي باشد. RNA مداخله گر مي تواند در كاهش بيان ژني اپي توپ هاي امگا گليادين كه باعث ايجاد حساسيت غذايي وابسته به گندم (WDEIA) مي شود، مورد استفاده قرار گيرد. حساسيت غذايي يا آنافيلاكسي وابسته به گندم از آنجا منشا مي گيرد كه آنتي بادي ها، به خصوص IgE در فرد بيمار، نقشي مخالف عمل محافظت كنندگي خود دارند. در گياهان، RNA دو رشته اي با انتهاي آزاد دو يا سه نوكلئوتيدي بخاطر قابليت شناسايي با آنزيم Dicer يكي از اركان مهم RNA مداخله گر محسوب مي شود. بنابراين توجه به ايجاد انتهاي آزاد ʹ3 با نوكلئوتيد هاي گوانين-سيتوزين در RNAi دورشته اي اختصاصي ژن امگا گليادين با عملكرد بالا هدف گيري شد. در اين تحقيق عملكرد بالاي ساختار ثانويه RNA دو رشته اي با محتواي نوكلئوتيدي گوانين-سيتوزين 35 تا 50 درصد بررسي شد. قطعات سنس و آنتي سنس طبق نقشه كاست در ناقل pTG19-T همسانه سازي شده و سپس براي توليد و ارزيابي مولكول RNAi مورد نظر به ناقل بياني pAHC25 منتقل شد. انرژي آزاد موثر براي آنزيم Dicer، تغييرات نوكلئوتيدي براي نواحي RNA دو رشته اي و درصد گوانين-سيتوزين مورد ارزيابي اوليه قرار گرفتند. بطوري-كه در ناحيه انتخابي براي ساخت كاست، ميزان نوكلئوتيد هاي گوانين- سيتوزين در حدود 35/7 الي 45/2 درصد و انرژي آزاد 24/7- الي 28/7- كيلوكالري برمول ارزيابي شد. پس از همسانه سازي موفق قطعه سنس، شباهت 100 درصدي براي ناحيه تشكيل دهنده ساقه سنجاق سري (hair-pin stem) به طول 185 جفت باز حاصل شد. طبق نقشه كاست توالي باقي مانده از قطعه سنس نيز نقش فاصله انداز و يا تشكيل دهنده لوپ در مولكول RNAiرا ايفا نمود. سرانجام، با انتقال كاست RNAi به ناقل بياني pAHC25، ناقل خاموشي اختصاصي و با راندمان بالا براي ژن امگا گليادين نوع 1D حاوي اپي توپ WDEIA توليد شد.

Nucleotide sequence homology based technology of interfering ribonucleic acid (RNAi) is a powerful tool for silencing targeted gene. RNAi technology can be used to reduce gene expression of omega-gliadin epitopes that cause food allergies related to wheat (WDEIA). The food allergy or wheat dependent anaphylaxis is originated from antibodies, especially IgE in the patient, which plays against their common protective role. In plants, RNA duplex with the free end of 2 or 3 nucleotides is accounted one of the important components of RNA interference due to recognizing capability of enzyme Dicer. So, attention to the guanine-cytosine nucleotides in free 3'end of omega-gliadin gene-specific RNAi duplex with high-performance has been targeted. In this study, high-performance double-stranded RNA secondary structure containing 35 to 50% cytosine-guanine nucleotides was investigated. The sense and antisense fragments were cloned according to work plan in pTG19-T cloning vector and then were transferred to the expression vector pAHC25 to produce and evaluate the RNAi molecules. Free effective energy of Dicer, nucleotide changes at the double-stranded RNA areas and the percentage of guanine-cytosine were initially assessed. So in selected area for construction of the cassette, cytosine-Guanine content of 35.7 to 45.2 % with free energy of 7/24 to 7/28 Kcal were evaluated. After the successful cloning of antisense fragment, 100 percent homology with a length of 185 bps was obtained for stem of hair-pin RNA molecule. According to the cassette plan, rest of the antisense sequence played spacer role or loop forming part at hair pin RNAi. At the end by transferring RNAi cassette to the expression vector pAHC25, efficient quenching vector of omega-gliadin gene type of D1 containing WDEIA epitopes was produced.