شناسايي ايزومرهاي آپوكاروتنوئيد كروسين و كروستين موجود در عصاره خام زعفران (Crocus Sativus) از طريق كروماتوگرافي مايع مجهز به طيف سنجي جرمي

Identification of Apo- Carotenoids' Crocin and Crocetin Isomers in Saffron Crude Extracts by HPLC Coupled to Atmospheric Pressure Chemical Ionization and High Resolution Orbitrap Mass Spectrometry

از مهمترين متابوليت ها در زعفران آپوكاروتنوئيدهاي كروستين و كروسين مي باشند. رنگ زعفران بطور عمده به ميزان و كيفيت حضور ماده كروسين بستگي دارد كه خود فرم استري گليكوزيله شده ماده كروستين توسط آنزيم گليكوزيل ترانسفراز مي باشد. در اين مطالعه به جداسازي و شناسايي اين متابوليت ها در عصاره متانولي و كلرفرمي كلاله زعفران در مرحله گرده افشاني با دستگاه كروماتوگرافي مايع مجهز به طيف سنجي جرمي (LC-APCI-MS) پرداخته شده است. شناسايي ايزومرهاي سيس و ترانس آپوكاروتنوئيدهاي كروسين و كروستين بر اساس سه مولفه طيف جرمي اين تركيبات در فاز يون منفي، زمان بازداري و دامنه جذبي آنها صورت پذيرفت. تغيير اين پارامترها در شناسايي ايزومرهاي كروسين بر اساس موقعيت اتصال واحدهاي UDP- گلوگز و جنتيوبيوزيل به آپوكاروتنوئيد كروستين و هم چنين تعداد اين واحدهاي اتصال يافته به اين تركيب امكان شناسايي فرم هاي مختلف كروسين را ميسر مي سازد. از تعداد 9 تركيب شناسايي شده دو تركيب مربوط به متابوليت هاي پيكروكروسين و كروستين و بقيه به عنوان ايزومرهاي سيس و ترانس كروسين ها شناسايي شدند. فرم هاي مختلف شناسايي شده كروسين ها كه از جمله تركيبات مهم قطبي گروه متابوليت هاي كاروتنوئيدي در كلاله زعفران مي باشند به فرم استرهاي كروستين -گلوكز (بتا دي گلوكوپيرانوزيل) و جنتيوبيوز (بتا دي گلوكوپيرانوزيل دي گلوكز) شناسايي گرديدند. هم چنين يون هاي شارژ مضاعف با توجه به تقارن بالاي مولكولي تنها براي ايزومر ترانس كروسين-4 مشاهده گرديد. دستگاه كروماتوگرافي استفاده شده در اين تحقيق ابزاري قدرتمند براي بررسي تركيبات موجود در منابع گياهي هم چون زعفران بوده كه استفاده از روش APCI-MS در فاز يون منفي امكان تفكيك و شناسايي دقيق انواع مختلف فرم هاي استري ايزومرهاي كروسين را عمدتا بر پايه تشخيص يون هاي مرتبط با قطعات حاصل از كاهش واحدهاي گلوكوزيل يا جنتيوبيوزيل و هم چنين قطعات حاصل از شكست هاي مولكولي، امكانپذير مي سازد.

The main metabolites in saffron are the Apo- carotenoids’ Crocin and Crocetin. Color intensity and quality of saffron mostly depend on the presence of Crocins that are glycosylated steric form of Crocetin by glycosyltransferase enzyme. The aim of this study is the characterization of these metabolites in methanolic and chloroformic extracts of saffron stigmas during anthesis stage by LC-APCI-MS. Identification of cis and trans isomers of Crocin and Crocetin was done by three parameters such as mass spectra registered in the negative ion mode، retention time and absorption ratio related to each metabolites. The variability of these parameters made it possible to detect the Crocins isomer with regard to the attached position and the number of UDP- glucose and Gentiobiosyl molecules to Crocetin structure. Crocins was the mainly detected components as there are polar components that are classified in the carotenoeids groups and the strified form of Crocetin Glucose (β-D-Glucopyranosyl) and Gentiobiose (β-D-Glucopyranosyl-D-Glucose). Also doubly charged ions were found for trans-isomers of Crocin-4، due to the high symmetry of their molecules. Based on the data gathered، the applied chromatograph Machin in this project is accurate and it is most sensitive tools to investigate about plants’ natural components like saffron، also the used APCI-MS in negative ions mode is the most efficient method to distinguish different steric forms of Crocin based on the ion’s fragments related to united reduction of glycosyl and gentiobiosyl as well as molecular fractions.