تعيين هويت مولكولي مايكوباكتريوم توبركلوزيس كمپلكس در بيماران استان فارس به وسيله تكنيك هاي RD Typing و PCR-RFLP

Molecular Identification of Mycobacterium tuberculosis Complex by RD-Typing and PCR-RFLP Method

بيماري سل، بيماري زئونوزي است كه به عنوان يكي از مهم ترين بيماري هاي تهديد كننده انسان و دومين عامل عفوني در انسان مي باشد. تمايز گونه هاي مختلف كمپلكس مايكوباكتريوم توبركلوزيس به روش هاي معمول زمان برو از طرفي، تشخيص دقيق جهت درمان به موقع بيماران، نقش حياتي را ايفا مي نمايد. لذا هدف از اين مطالعه، شناسايي جنس مايكوباكتريوم و تعيين هويت مولكولي مايكوباكتريوم توبركلوزيس كمپلكس در بيماران استان فارس به وسيله تكنيك هاي RD typing و PCR-RFLP بود. ژنوم 50 جدايه با استفاده از روش جوشاندن استخراج گرديد. براي تعيين جنس اين جدايه ها از تكنيك PCR بر اساس قطعه 16S rRNA استفاده گرديد. تكنيك PCR IS6110 و تكنيكRD typing نيز به ترتيب براي شناسايي و تعيين هويت باكتري مورد استفاده قرار گرفت. در نهايت، با استفاده از تكنيك هاي RD typing و PCR-RFLP بر روي ژن oxyR جهت تعيين هويت مايكوباكتريوم /تعيين گونه مايكوباكتريوم انجام شد. تمامي جدايه ها با استفاده از تكنيك PCR براي16S rRNA باند 543 جفت باز را نمايش دادند و با استفاده ازPCR برايIS6110، باند 245 جفت باز را نمايش دادند كه مايكوباكتريوم توبركلوزيس كمپلكس را اثبات كردند. در تعيين هويتRD typing،RD1، RD4، RD9 و RD12 به ترتيب باندهاي 146،172،235و 365 شناسايي شدندكه مشخص شد تمامي جدايه هاي مورد مطالعه گونه توبركلوزيس مي باشند. با استفاده از تكنيك PCR-RFLP روي ژن كاذب oxyR هويت مولكولي RD typing تاييد شد. نتايج در اين مطالعه نيز نشان دهنده قدرت تكنيك RD typing درتمايز بين مايكوباكتريوم ها مي باشد و مشخص گرديد تمام جدايه هاي ارسالي از شيراز، مايكوباكتريوم توبركلوزيس هستند و مايكوباكتريوم بويس مشاهده نشد. عدم وجود گونه بويس در جدايه هاي ارسالي از شهر شيراز، نشان دهنده بهداشت مناسب شير پاستوريزه در اين شهر مي باشد.

Tuberculosis is still considered as one of the most important zoonotic diseases and the cause of infectious death and human casualties. The main purpose of this study was to set up and diagnose Mycobacterium tuberculosis complex isolates in patients of FARS، Shiraz using the Regions of Difference (RD) typing and RFLP techniques. The genomes of 50 isolates were extracted by boiling method. To determine the genus of the isolates، PCR technique based on 16 s rRNA was used. IS6110 PCR and RD typing were used for the detection of Mycobacterium tuberculosis complex. Finally، the PCR-RFLP method was used as a comparing method for comparative evaluation of RD typing to identify mycobacteria. Amplification of 543 bp bands in 16s rRNA PCR showed that all studied isolates belonged to the genus Mycobacterium. In IS6110 gene PCR، it was shown that all isolates were Mycobacterium tuberculosis complex due to the amplification of 245 bp bands. In RD typing the identification was based on RD1، RD4، RD9 and RD12. The comparative method of PCR-RFLP on pseudo gene oxyR showed that all isolates were Mycobacterium tuberculosis. Using RD-typing، it was found that all isolates achieved from Shiraz were Mycobacterium tuberculosis. The absence of Mycobacterium bovis isolates represents good hygiene and consumption of pasteurized milk in this city. The results of this study also reflect the ability of RD typing technique in differentiation of mycobacteria.