مقايسه عملكردي مونوسيت‌هاي جدا شده از فلاسك‌هاي كشت در روش‌هاي ليدوكائين/EDTA ، تريپسين و PBS سرد/EDTA

Functional Comparison of monocytes isolated from culture flask by lidocaine/EDTA, trypsin and cold-PBS/EDTA

چكیده زمینه و هدف: دسترسی آسان، استحصال سریع و پتانسیل بالای درمانی سلول‌های مونوسیت، موجب شده كه در تحقیقات سلول درمانی توجه ویژه‌ای به این سلول شود. مونوسیت‌ها از جمله سلول‌های چسبنده به فلاسك محسوب می‌شوند، بنابراین یافتن روش جداسازی مناسب كه كمترین آسیب به سلول و عملكرد آن برساند از اهمیت خاصی برخوردار است. هدف از این مطالعه  مقایسه قابلیت‌های عملكردی مونوسیت بعد از جداسازی با سه روش لیدوكائین/EDTA ، تریپسین و PBS سرد/EDTA بود..   روش بررسی: در این مطالعه تجربی،بعد از استخراج سلول­های تك هسته­ای خون محیطی از موش بالب سی، سلول­ها(107×1 سلول در میلی لیتر) در محیط كشت RPMI در فلاسك كشت T25 به مدت 4 ساعت انكوبه شدند. بعد از اتمام زمان انكوباسیون سلول­های غیر چسبنده (عمدتاً لنفوسیت‌ها) با دو بار شستشوی آرام جدا شده و از فلاسك خارج شد. سپس برای جداسازی سلول­های مونوسیت چسبیده از 3 روش تریپسین، روش لیدوكائین و فسفات بافر سالین سرد استفاده و بعد از جداسازی سلول­ها با هر روش، قابلیت­های عملكردی مونوسیت­ها سنجیده شد و با هم دیگر مقایسه شدند. داده­های جمع‌آوری شده با استفاده آنالیز  واریانس یك طرفه تجزیه و تحلیل شدند.   یافته­ها: میزان استحصال، زنده مانی، فعالیت متابولیك، درصد فاگوسیتوز، انفجار تنفسی، میزان نیتریك اكساید و قابلیت مخمر كشی در سلول­هایی كه با روش لیدوكائین جداشده بودند، نسبت به گروه­های دیگر به طور معنی‌داری بیشتر بود. هرچند كه شیوه استفاده از تریپسین با وجود اینكه موجب استحصال سلول بیشتری نسبت به روش PBS سرد می­شود، ولی این سلول­ها در مقایسه با روش لیدوكائین/EDTA و یا PBS سرد/EDTA، اختلال فیزیولوژیك قابل توجهی دارند. برداشت نوترال رد به وسیله سلول‌های مونوسیت جداسازی شده با روش تریپسین نسبت به دو روش دیگر در سطح پایین­تری بود. در مقایسه بین شیوه PBS سرد و لیدوكائین به نظر می­رسد كه  بین مونوسیت­های به دست آمده از دو روش فوق، از نظر برداشت نوترال رد اختلاف معنی‌داری وجود ندارد.   نتیجه‌گیری: در مقایسه با روش‌های تریپسین وPBS سرد/EDTA، روش لیدوكائین/EDTA یك مناسب جهت جداسازی مونوسیت‌های چسبیده به كف فلاسك به دلیل استحصال سلول‌های بشتر و كارآمد می­باشد.    

Abstract   Background & aim: Easy access, rapid recovery and high potency of monocyte cell therapy have led to special attention in cell therapy research. Monocytes are considered as sticky cells to the flask. Therefore, finding the appropriate isolation method that has the least damage to the cell and its function is of particular importance. The purpose of this study was to compare the functional capabilities of monocytes after isolation with three methods: lidocaine / EDTA, trypsin and cold PBS / EDTA.   Methods: In this experimental study, after extraction of peripheral blood mononuclear cells from Balb / c mice, cells (107 × 1 cells / ml) were incubated in RPMI culture medium in T25 culture flask for 4 hours. After incubation time, non-adherent cells (mainly lymphocytes) were separated by two rinsing and removed from the flask. Three different methods of trypsin, lidocaine and phosphate buffer saline were used for isolation of monocyte cells. After isolating the cells with each method, the functional capabilities of the monocytes were measured and compared with each other. The collected data were analyzed using one-way ANOVA.   Results: The amount of extraction, survival, metabolic activity, phagocytosis percentage, respiratory explosion, nitric oxide levels, and yeast potential in cells isolated by lidocaine were significantly higher than other groups. Although the use of trypsin, although it results in the removal of more cells, is cooled to the PBS method, but these cells exhibit significant physiological impairment in comparison with the Lidocaine / EDTA or PBS / EDTA method. Neutral red uptake was detected by trypsin isolated monocyte cells in comparison to the other two methods at lower levels. In comparison between cold PBS and lidocaine, it seems that there is no significant difference between the monocytes obtained from the two methods in terms of neutralization.   Conclusion: Compared to trypsin and PBS / EDTA, the Lidocaine / EDTA method is an appropriate method for isolating monocytes adherent to the flask, due to the extraction of more efficient and efficient cells.   .