بررسي وجود ژن cry در باسيلوس ترينجينسيس ‌هاي جدا شده از خاك

The characterization Molecular of cry genes in the Bacillus thuringiensis isolated from soil

چكیده زمینه و هدف: باسیلوس ترینجینسیس باكتری گرم مثبت و اسپورزا است. اصلی‌ترین زیستگاه این باكتری خاك بوده و توانایی تولید انواع متنوعی از پروتئین‌های كریستالی با خاصیت حشره‌كشی را داراست. هدف از این مطالعه جداسازی سویه‌های باسیلوس ترینجینسیس حمل كننده ژن  Cryاز خاك های نقاط مختلف استان تهران  با استفاده از روش Multiplex-PCR بود.   روش بررسی: در این مطالعه توصیفی ـ تحلیلی مقدار 200 گرم خاك  از عمق 10 سانتی متری به طور تصادفی و در مجموع تعداد 100 نمونه خاك از مناطق مختلف شهر تهران جمع‌آوری شد. سپس بر اساس پروتوكل تأیید شده به وسیلهWHO، كلنی‌های مشكوك به باسیلوس تورنجینسیس جداسازی و ایزوله ها از نظر تست های میكروبیولوژیكی و بیوشیمیایی تأیید شدند. پس از استخراج DNA  از تمامی‌سویه‌ها، با استفاده از  16S rDNA PCR Sequencing باسیلوس ترینجینسیس بودن سویه‌های حاوی ژن Cry تأیید شد، داده‌ها با استفاده از آزمون آماری واریانس یك طرفه تجزیه و تحلیل شدند.   یافته‌ها: در نمونه‌های خاك مورد بررسی، 41 سویه باسیلوس تورینجنسیس شناسایی شد. نتایج MPCR نشان داد كه از 14 سویه حامل توكسین كریستالی، 7 سویه (50 درصد) به تنهایی واجد ژن cry1، 4 سویه (5/28درصد) به تنهایی واجد ژن cry2 و 3 سویه (5/21 درصد) به تنهایی واجد ژن cry3 بودند و باندهای مربوطه را نشان دادند. ژنcry4 و cry5 در هیچ‌كدام از ایزوله‌ها (صفردرصد) مشاهده كن.     نتیجه گیری: با توجه به تنوع بسیار زیاد ژن پروتئین كریستالی و عدم وجود روش‌های فنوتیپی دقیق در شناسایی حضور پروتئین كریستالی، بنابراین تشخیص هم‌زمان این ژن‌ها می‌تواند با هزینه اندك و سرعت‌العمل زیاد باسیلوس‌های حاوی ژن كریستالی را شناسایی نماید.      

    Background & aim: Bacillus thuringiensis (Bt) is a Gram-positive and sporulating bacteria. The main habitat of the bacteria is soil and able to produce a wide variety of insecticidal crystal proteinʹs with Insecticide properties. The aim of the study was to detection of cry1, cry2, cry3, cry4 and cry5 genes in the B. thuringiensis isolated from soil samples by Multiplex-PCR method. Methods: In this cross-sectional study, 200 grams of soil sample randomly were collected from at 10 cm depth and totally 100 soil samples were taken from different areas of Tehran, Iran. According to the protocol approved by WHO, suspected colonies on B. thuringiensis isolated and strains were confirmed by the microbiological and biochemical tests. After DNA extraction Multiplex-PCR using specific primers in thermal cycler gradient the presence of cry genes were confirmed. Data were analyzed using one-way ANOVA.   Results: Out of 100 soil samples studied, 41 strains were confirmed as B. thuringiensis. MPCR results showed that 14 strains carrying the crystalline toxin, 7 strains (50%) cry1, 4 strains (5.28%) cry2 and 3 strains (5.21%) cry3 genes. Cry4 and cry5 genes were not observed in any isolates (0.0%).   Conclusion: Based on great diversity of crystal protein genes and the absence of reliable phenotypic methods for detection of the presence of crystal proteins, simultaneous identification of these genes can be found as low cost and high speed response for identification of crystalline genes produced by B. thuringiensis.