تاثير اكسين‌هاي IBA، NAA و 2, 4- D بر توليد و رشد كالوس در گونه سرخدار (Taxus baccata L.) در شرايط درون شيشه‌اي

The effect of IBA, NAA and 2, 4- D on callus production and growth in common yew (Taxus baccata L.) on in vitro conditions

سابقه و هدف: سرخدار يكي از با ارزشترين گونه­ هاي سوزني­برگ جنگل­هاي شمال ايران است كه گونه اي سايه­پسند بوده و از آستارا تا علي ­آباد كتول استان گلستان پراكنش دارد. اين گونه ضمن داشتن ارزش فراوان از نظر ذخاير ژنتيكي، جنگل شناسي و اكولوژيكي، در صنعت دارويي نيز جايگاه ويژه­اي دارد. از آنجائيكه كالوس به عنوان ماده اوليه براي كشت­ هاي سلولي و توليد متابوليت­ هاي ثانويه و نيز توليد گياهچه به روش غيرمستقيم ضروري مي­باشد، لذا به منظور پيشنهاد ريزنمونه مناسب و غلظت معيني از تنظيم ­كننده­ هاي رشد جهت توليد كالوس، تأثير اكسين­هاي ايندول بوتريك اسيد (IBA)، نفالين استيك اسيد (NAA) و 2و 4 دي­كلروفنوكسي استيك اسيد (2, 4- D) بر ميزان توليد و رشد كالوس سرخدار در شرايط درون شيشه­ اي مورد بررسي قرار گرفت. مواد و روش ­ها: در اين پژوهش از قسمت­هاي مختلف درخت نظير برگ، ساقه­ هاي جوان و جوانه­ هاي رويشي ريز نمونه­ هايي به طول 1/5 سانتي­متر تهيه شد. براي سترون­ سازي ريزنمونه­ ها از روش­ هاي مختلفي استفاده شد. ريزنمونه­ ها پس از سترون ­سازي در محيط كشت موراشيگ و اسكوگ (MS) كشت شدند. جهت القاء كالوس از هورمون­هاي IBA، NAA و 2,4- D در چهار سطوح 0، 0/3، 3 و 6 ميلي­گرم در ليتر استفاده شد. به منظور جلوگيري از تجزيه اكسين­ ها و جذب بهتر آنها توسط بافت ريزنمونه، كليه ريزنمونه­ ها به مدت يك هفته در شرايط تاريكي نگه داشته شدند. براي هر يك از ريزنمونه­ هاي ساقه، برگ و جوانه منحني رشد كالوس ترسيم گرديد. تجزيه و تحليل داده ­ها توسط آزمون تجزيه واريانس و آزمون دانكن انجام شد. يافته­ ها: نتايج پژوهش نشان داد كه بهترين روش براي سترون­ سازي ريزنمونه­ ها استفاده از اتانول 70 درصد (1 دقيقه) و كلريد جيوه 0/2 درصد و كلرور كلسيم 0/2 درصد (1 دقيقه) مي­باشد. بيشترين درصد قهوه ­اي شدن به ريزنمونه ­هاي جوانه در غلظت 6 ميلي­گرم در ليتر NAA تعلق داشت. ريزنمونه­ هاي برگ از نظر پديده قهوه ­اي شدن از وضعيت بهتري برخوردار بودند، بطوريكه در غلظت­ هاي مختلف IBA و 2, 4- D هيچگونه آثار قهوه­ اي شدن مشاهده نشد. بيشترين وزن تر و خشك كالوس به ريزنمونه­ هاي ساقه و جوانه تعلق داشت كه به ترتيب تحت تيمار هورمون ­هاي 2, 4- D و NAA با غلظت 3 ميلي­گرم در ليتر بودند. ضمن ­اينكه كالوس ­هاي توليد شده داراي بافت و رنگ متفاوتي بودند. بيشتر ريزنمونه­هاي جوانه در غلظت 0/3 ميلي­گرم در ليتر NAA وضعيت طبيعي خود را حفظ كرده ولي عمده جوانه­ ها در غلظت 6 ميلي­گرم در ليتر IBA و 2, 4- D به كالوس تبديل شدند. منحني ­هاي رشد كالوس در ريزنمونه­ هاي مختلف نشان دادند كه شروع كالوس­ دهي و رشد آن داراي سرعت نسبتاً پائيني است. نتيجه ­گيري: درصورتيكه هدف، توليد كالوس از ريزنمونه­ هاي ساقه و برگ سرخدار باشد،2, 4- D با غلظت 3 ميلي­گرم در ليتر، و براي توليد كالوس از جوانه انتهايي غلظت 3 ميلي­گرم در ليتر NAA و چنانچه توليد گياهچه از جوانه­ هاي سرخدار مد نظر باشد غلظت 0/3 ميلي­گرم NAA به عنوان پروتكل­ هايي مناسب، پيشنهاد مي­گردند.

Background and objectives: Common yew (Taxus baccata L.) is one of the most valuable coniferous species in the northern forests of Iran which is shade tolerant and its distribution is from Astara to Ali Abad Katoul (Golestan province). This species additional to having genetic reservation, silvicultural and ecological values, has the special advantage in drug industry. As callus is a primary substance for cell cultures and secondary metabolite's production and indirect organogenesis, therefore, in order to suggest a suitable explant and definite concentration of growth regulators for callus production, the effect of Indole-3- butyric acid (IBA), α-Naphtaleneacetic acid (NAA) and 2, 4- Dichlorophenoxyacetic acid (2, 4- D) on callus production and growth in common yew under in vitro conditions were considered. Materials and methods: In this research, the explants were provided from different parts of the tree such as leaf, young stems and apical buds with 1.5 cm lengths. For sterilization of explants different methods were used. The explants were cultured in Murashige and Skoog medium after sterilization. For callus induction from IBA, NAA and 2, 4- D in 4 levels (0, 0.3, 3 and 6 mg L-1) were used. In order to prevention of auxins decomposition and their better absorption by explants texture, all of the explants were maintained in dark conditions for a week. For each explants of stem, leaf and bud callus growth curve were drawn. Data were analyzed with ANOVA and Duncan tests. Results: The results were shown that the best method for explants sterilization was ethanol 70% (for 1 min), HgCl2 0.2 % and CaCl2 0.2% (for 1 min). The maximum percentage of browning was observed in bud explants at concentration of 6 mg L-1 NAA. The leaf explants were better than other explants in the browning phenomenon, so that there was no evidence of browning in different concentration of IBA and 2, 4- D. The maximum wet and dry weight of callus was belonging to stem and bud explants under treatments of 2, 4- D and NAA at concentration of 3 mg L-1, respectively. In addition, the produced calluses had different texture and color. Most of bud explants at concentration of 0.3 mg L-1 NAA were normal conditions but at concentration of 6 mg L-1 IBA and 2, 4- D, they were converted to callus. The callus growth curves in different explants showed that initiation and callus production and its growth is having a relatively low rate. Conclusion: 2, 4- D at concentration of 3 mg L-1 for callus production from yew stem and leaf explants, NAA at concentration of 3 mg L-1 for callus production from apical bud and NAA at concentration of 0.3 mg L-1 for plantlet production from yew bud are suggested as suitable protocols.