جداسازي، تاييد هويت و بررسي قابليت جذب سلولي اگزوزوم‌هاي مشتق از سلول‌هاي بنيادي مزانشيمي مغز استخوان انساني

Isolation, Characterization and Cellular Uptake of Exosomes Derived from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

هدف: ميكرووزيكول‌هاي مشتق از سلول به‌عنوان مكانيسمي نوين در زمينه ارتباطات سلول-سلول شناخته مي‌شوند. اگزوزوم‌هاي مشتق از سلول‌هاي بنيادي مزانشيمي به‌عنوان مكانيسمي نوين در زمينه عملكرد پاراكراين سلول‌هاي بنيادي مزانشيمي قلمداد مي‌شوند. در اين راستا، اگزوزوم‌ها نقشي مهم در ارتباطات بين سلولي مابين سلول‌هاي بنيادي مزانشيمي و سلول‌هاي توموري بر عهده دارند. مواد و روش‌ها: اگزوزوم‌ها از محيط كشت سلول‌هاي بنيادي مزانشيمي توسط سانتريفوژ افتراقي تخليص شد. اندازه و شكل ظاهري اگزوزوم‌هاي مشتق از سلول‌هاي بنيادي مزانشيمي توسط ميكروسكوپ الكتروني نگاره بررسي شد. همچنين، اندازه اگزوزوم‌ها توسط تفرق ديناميكي نور سنجيده شد. آناليز وسترن بلات براي نشانگر اگزوزومي CD9 انجام شد. اگزوزوم‌هاي تخليص شده با رنگ فلورسنت PKH نشان‏دار شد. سلول‌هاي توموري تخمدان SKOV3 با اگزوزوم‌هاي نشان‏دار شده تيمار و جذب سلولي توسط ميكروسكوپ فلورسنت بررسي شد. نتايج: ميكروسكوپ الكتروني نگاره نشان داد كه اگزوزوم‌هاي مشتق از سلول‌هاي بنيادي مزانشيمي داراي شكلي كروي با قطر مابين 30 الي 100 نانومتر است. همچنين اندازه اگزوزوم‌ها توسط سنجش فرق ديناميكي نور توزيع اندازه زنگوله‌اي شكل با بيشينه فراواني 80 نانومتر را نشان داد. آناليز وسترن بلات نيز بيان CD9 (نشانگر ويژه اگزوزومي) در اگزوزوم‌هاي تخليص شده را نشان داد. همچنين بررسي ميكروسكوپ فلورسنت نشان داد كه اگزووزم‌هاي نشان‏دار شده با رنگ PKH26 مي‌تواند توسط سلول‌هاي توموري SKOV3 با كارآمدي بالا جذب شود. نتيجه‌گيري: روش ارايه شده در زمينه جداسازي اگزوزوم‌ها از سلول‌هاي بنيادي مزانشيمي و تاييد ماهيت و جذب آن‌ها توسط سلول‌هاي توموري، گامي مهم و پيش نياز در زمينه درك عملكرد اگزوزوم‌ها در سلول‌هاي توموري براي مطالعات آينده است. بديهي است توانايي در مطالعه زيستي جذب اگزوزوم‌ها توسط سلول‌هاي سرطاني فرصت‌هاي جديدي در زمينه بررسي‌هاي عملكردي اين نانووزيكول‌هاي طبيعي و محتويات آن‌ها در زمينه درمان سرطان فراهم مي‌آورد.

Objective: Cell-derived microvesicles are described as a new mechanism for cell-to-cell communication. Stem cell-derived exosomes have been described as a new mechanism for the paracrine effects of mesenchymal stem cells (MSCs). In this regard, exosomes may play a relevant role in the intercellular communication between MSCs and tumor cells. Methods: Exosomes were purified from the conditioned medium of MSCs by differential centrifugation. Exosome size and morphology were examined by scanning electron microscope and sized with dynamic light scattering (DLS). Western blot analysis confirmed the exosomes by using CD9 as a marker. Purified exosomes were labeled with a PKH26 red fluorescent labeling kit. The labeled exosomes were incubated with SKOV3 ovarian tumor cells for 12 h at 37°C, and we used an inverted fluorescence microscope to monitor cellular uptake. Results: Scanning electron microscopy revealed that the purified MSCs-derived exosomes had a spherical shape with a diameter of approximately 30-100 nm. Exosome size measurement by dynamic light scattering analysis also showed a single bell-shaped size distribution with a peak of ~80 nm. Western blot analysis also demonstrated the presence of CD9 (a representative marker of exosomes) in the purified exosomes. These data confirmed that the vesicles isolated from MSCs-conditioned media were the exosomes based on their size and presence of the protein marker CD9. Florescent microscopy showed that PKH26-labeled exosomes could be taken up by SKOV3 tumor cells with high efficiency. Conclusion: Our approach for isolation, characterization and cellular uptake of exosomes derived from MSCs is valuable and a prerequisite for future studies that intend to discover exosome function in tumor cells. The ability to study the biology of exosome uptake in cancer cells could provide opportunities for functional studies of these natural nanovesicles and their contents in cancer therapy.