پايش اثر نانوكوركومين روي سميت سرب در رده سلولي Huh7-1x-ARE-luc

Monitoring the Nanocurcumin Effect on Lead Exposure in the Huh7-1x-ARE-luc Cell Line

هدف: ژنوم انسان حاوي ژن‏هاي محافظت كننده است كه داراي توالي عوامل پاسخ‏گو به آنتي اكسيدان‏ها در پروموترشان است كه بيان آن‏ها به‏طور خاص تحت تاثير عامل رونويسي Nrf2 قرار مي‏گيرد. اين مسير پيام رساني (ARE\KEAP1) عمده‏ترين مكانيسم دفاعي در برابر استرس اكسيداتيو است. رده سلولي حاوي عوامل پاسخ‏گو به آنتي اكسيدان‏ها (ARE)، سلول‏هاي گزارشگر حساسي هستند كه براي تشخيص عوامل فعال كننده پاسخ‏گو به آنتي اكسيدان‏ها به‏كار مي‏روند و مي‏توانند در شناسايي مواد اكسيداتيو همچون سرب كمك كننده باشند. مواد و روش‏ها: در اين مطالعه از رده سلولي پايدار Huh7-1x-ARE-luc توليد شده، استفاده شد. مهار فعاليت متابوليكي سلول‏هاي Huh7 در غلظت‏هاي مختلف سرب (0 تا 80 ميكرومولار) توسط آزمون MTT سنجيده شد. در ادامه رده سلولي Huh7-1x-ARE-luc براي بررسي آثار استرس اكسيداتيو با سرب به‏عنوان يك تركيب القا كننده استرس اكسيداتيو و نانوكوركومين به‏عنوان يك آنتي اكسيدان در غلظت‏هاي متفاوتي از اين تركيبات تيمار شد و سپس ميزان فعاليت لوسيفرازي زيست‏حسگر بررسي شد. همچنين ميزان بيان ژن‏هاي مسير ARE\KEAP1 توسط Real time PCR تعيين شد. نتايج: نتايج نشان مي‏دهد كه غلظت 30 ميكرومولار سرب باعث مهار متابوليكي 50 درصدي سلول‏هاي Huh7 مي‏شود. فعاليت لوسيفرازي سلول‏هاي تيمار شده با غلظت‏هاي 4 و 8 ميكرومولار از نانوكوركومين و غلظت 30 ميكرومولار از سرب نسبت به كنترل ( 30 ميكرومولار سرب) كاهش يافته است و با افزايش غلظت نانوكوركومين به 16 ميكرومولار اين فعاليت افزايش مي‏يابد. نتايج تحليل داده‏هاي حاصل از Real time-PCR نشان مي‏دهد كه بيان تمامي ژن‏هاي مورد بررسي شامل Nrf2 و NQO1 در رده سلولي Huh7-1x-ARE-luc تيمار شده با سرب 30 ميكرومولار و نانوكوركومين 4 و 8 ميكرومولار نسبت به تيمار همان ژن‏ها با سرب 30 ميكرومولار كاهش يافته است. از سوي ديگر؛ بيان اين ژن‏ها در سلول‏هاي تيمار شده با سرب 30 ميكرومولار و نانوكوركومين 16 ميكرومولار نسبت به تيمار همان ژن‏ها با سرب 30 ميكرومولار افزايش داشته است. نتيجه‏گيري: نانوكوركومين به‏عنوان يك آنتي‏اكسيدان توانسته اثر سميت سرب را احتمالاً از طريق مسير ARE\KEAP1 به‏طور معني‏داري كاهش دهد؛ در نتيجه مي‏تواند به‏عنوان يك آنتي‏اكسيدان در كاهش استرس اكسيداتيو استفاده شود.

Objective: The human genome consists of protective genes, which contain a sequence known as the antioxidant responsive element (ARE) located in their promoter regions. ARE is specific to the transcription factor NF-E2 related factor2 (Nrf2). This signaling pathway is the major defense mechanism against oxidative stress that comprises the chemoprotective response. The cell line that expresses the ARE reporter is sensitive for the detection of ARE activating compounds. It can help to identify toxicity risk and antioxidant activity of chemicals and drugs. Methods: We used a stable Huh7 ARE-reporter cell line in this study. Metabolic activity of these cells in different concentrations of lead (0 to 80 micromole) was evaluated by the MTT test. We assessed the effects of oxidative stress. We exposed the Huh7 ARE-reporter cell line to different concentrations of lead, an oxidative stress inducer, and nanocurcumin, an antioxidant compound, after which we investivated luciferase activity. Real-time PCR was used to detected ARE\KEAP1 pathway gene expression. Result: Lead, at 30 ?M, suppressed 50% of the cells’ metabolic activity. Cells treated with both lead (30 ?M) and nanocurcumin at 4 ?M and 8 ?M had decreased luciferase activity compared to those treated with only lead. This activity increased when we increased the nanocurcumin concentration to 16 ?M. Real-time PCR analysis showed decreased NQO1 and NRF2 expressions in cells treated with both lead (30 ?M) and nanocurcumin (4 ?M and 8 ?M) compared to just lead treated cells. However, NQO1 and NRF2 had increased expressions in cells treated with both lead (30 ?M) and nanocurcumin (16 ?M) compared to just lead treated cells. Conclusion: Nano curcumin, as an antioxidant, significantly reduced the toxic effects of lead toxic. This effect probably occurred through the ARE\KEAP1 pathway. Hence, nanocurcumin could be used as an antioxidant to reduce oxidative stress.