ساخت سازه پلاسميدي بيان‌كننده ژن mda-7 تغيير يافته به‌وسيله توالي iNGR و ارزيابي آن براي القاي مرگ سلولي برنامه‏ريزي شده در رده سلول سرطاني كبد

Construction of a Plasmid Expressing MDA-7 Gene Modified by an iNGR Sequence and Its Evaluation for Apoptosis Induction in a Hepatocellular Cancer Cell Line

هدف: ژن mda-7/IL-24 يك ژن سركوب‌گر تومور است. پپتيد iNGR با گرايش به اينتگرين‌هاي سطح سلول سرطاني در هدفمندسازي عوامل درماني عليه سلول‌هاي توموري به‌كار گرفته شده است. هدف اين مطالعه ساخت ژن mda-7/IL-24 متصل به پپتيد iNGR و مقايسه فعاليت آن با ژن طبيعي است. مواد و روش‏ها: در ابتدا، mda-7 با استفاده از روش PCR تكثير يافت. آغازگر برگشت حاوي توالي پپتيد iNGR بود تا اين توالي در انتهاي ژن mda-7 ايجاد شود. توالي ژن تغيير يافته mda7/iNGR و mda7 (كنترل) در ناقل بياني يوكاريوتي pCDNA3.1 دودمان‌سازي شدند. با استفاده از روش‌هاي هضم آنزيمي، colony-PCR و توالي‌يابي درستي دودمان‌سازي، يكپارچگي ناقل‌ها و توالي آن‌ها ارزيابي شد. با استفاده از ليپوفكتامين سازه‌ها در سلول‌هاي Ad-293 ترانسفكت و توانايي آن‌ها براي بيان پروتيين نوتركيب با استفاده از آزمايش الايزا ارزيابي شد. در ادامه، اين سازه‌ها به سلول‌هاي HepG2 ترانسفكت و بعد از استخراج mRNA با استفاده از روش Real time PCR بيان ژن‌هاي پيش آپوپتوزي Gadd153 و Bax اندازه‌گيري شد. با رنگ‌آميزي Anexin/PI و فلوسيتومتري ميزان مرگ برنامه‏ريزي شده در سلول HepG2 ارزيابي شد. نتايج: نتايج، درستي و يكپارچگي سازه‌ها را نشان داد. بيان مناسب و ترشح محصول mda-7. iNGR با كنترل آن يعنيmda-7 در سوپ رويي قابل مقايسه بود. نتايج زنده ماني نشان‌گر عدم مفيد بودن اين تغيير بر پروتيين mda-7 بوده است. بررسي مرگ سلولي برنامه‏ريزي شده با سنجش بيان ژن و فلوسيتومتري نيز نشان داد كه اتصال iNGR به mda-7 بر خاصيت مرگ‌زايي آن تاثير كاهنده داشته ولي در مقايسه با گروه كنترل منفي همچنان مرگ‌زايي معني‏داري دارد (01/0 > P). نتيجه‌گيري: ناقل بياني pCDNA/Mda-7.iNGR پروتيين mda-7 متصل به iNGR را به‌طور مناسب بيان كرد ولي بر خاصيت مرگ‌زايي طبيعي پروتيين تاثير بهينه‌اي نداشت.

Objective: Melanoma differentiation association gene-7 (MDA-7)/IL24 is a tumor suppressor gene. The iNGR peptide sequence, with excellent tropism to surface integrins has been employed for targeting of therapeutic molecules toward tumor cells. The purpose of our study was to construct a plasmid expressing modified MDA-7 fused with an iNGR peptide for better targeting to tumor cells. Methods: At first, we amplified the MDA-7 sequence by PCR, while the reverse primer contained the iNGR peptide sequence to add it to the end of a new MDA-7 gene. The resultant MDA7-iNGR and MDA-7 were cloned into a pCDNA3.1 eukaryotic expression vector. The accuracy of cloning methods, integrity of the plasmids, and sequence were sequentially evaluated by digestions, colony-PCR, and sequencing. The expressions of the plasmid constructs were assayed by ELISA following their transfection into Ad-293 cells. Next, the plasmids were transfected into Hep-G2 cells and their mRNA were converted to cDNA. We assessed the gene expression levels of Gadd153 and Bax. As the final step, apoptosis induction of Hep-G2 cells following transfection was evaluated by the help of PI/Annexin V staining according to flow cytometry. Results: The results showed the integrity of construct backbone in addition to reading frame of the MDA-7-iNGR sequence. A suitable expression/secretion of modified the MDA-7.iNGR protein was detected by ELISA assay of the culture supernatant when compared to the control construct that expressed unmodified MDA-7. The viabilty test demonstrated no benefit for this kind of modification of the MDA-7 protein. Real-time PCR and flow cytometry analyses revealed that the addition of iNGR to MDA-7 caused a decrease in its apoptotic effect on hepatic tumor cells compared to the normal protein. The modified protein had significant apoptosis induction compared to the negative control group (P < 0.01). Conclusion:Although the new pCDNA/MDA-7.iNGR plasmid expressed iNGR-fused MDA-7 protein efficiently, it could not improve the natural apoptosis property of normal MDA-7.