مقايسه روش‌هاي مختلف استخراج RNA در برگ سيب (Malus domestica)

Comparative study of different protocols for isolation of RNA from apple leaves (Malus domestica)

سابقه و هدف: جداسازي RNA از گياهاني كه داراي مقدار زيادي تركيب هاي پلي‌ساكاريد و پلي‌فنل مي‌باشند به علت اتصال و رسوب اين تركيب هاي با RNA مشكل است. بنابراين در اين مطالعه 11 پروتكل مختلف استخراجRNA از برگ‌هاي سيب غني از تركيب هاي فنلي مورد بررسي قرار گرفت. مواد و روش ها: كيفيت و كميت RNAبا الكتروفورز ژل آگارز 2/1% و اسپكتروفتومتري نانودراپ در طول موج 230، 260 و 280 نانومتر تعيين شد و سنتز cDNA و آناليز RT-PCR با پرايمر اختصاصي ژن اكتين سيب انجام گرفت. يافته ها: نتايج نشان داد كه روش استخراج جمي‌چات‌چايو و همكاران (2012) و راجاكاني و همكاران (2013) مناسب‌ترين روش‌هاي استخراجRNA از برگ سيب بودند. عملكرد RNA كل استخراج شده در اين روش‌ها به ترتيب بين 4/152 تا 2/800 و 1/362 تا 6/452 نانوگرم در ميكروليتر به دست آمد. باندهاي S18 و S28 در الكتروفورز افقي مشاهده شدند. بحث: در هر دو روش نسبت 260 به 280 و 260 به 230 به ترتيب بين 99/1 تا 03/2 و 07/2 تا 17/2 بود كه نشان دهنده خلوص بالايRNA و عدم آلودگي به پلي‌فنلي، پروتييني و پلي‌ساكاريدي مي‌باشد. نتيجه‌گيري: كيفيت بالاي واكنش RT-PCR در هر دو روش نشان داد كه RNA استخراج شده مي‌تواند با اطمينان جهت آزمايش‌هاي مولكولي پايين دستي مورد استفاده قرار گيرد.

Aim and Background: RNA isolation is difficult in plant that contain large amounts of polysaccharides and polyphenol compounds that bind and co-precipitate with RNA. Therefore, in this study eleven different methods were evaluated to extract RNA from leaves of apple rich in phenolic compounds. Material and methods:The quantity and quality of extracted RNA were determined by 1.2% nano-drop spectrophotometric at absorbance of 230, 260 and 280nm, agarose gel electrophoresis and cDNA synthesis and RT-PCR analysis by specific primer for apple Actin were performed . Results:The results indicated that methods of Djami-Tchatchou et al., (2012) and Rajakani et al.,(2013) were the most suitable methods for RNA extraction from apple leaves. The yield of total RNA extracted by these methods varies from 753.6 to 800.2 and 362.1 to 452.6 ng/µl in apple leaves , respectively. Distinct bands of 28S and 18S ribosomal RNA were observed in electrophoresis Discuss: In two protocols, ratios of A260/A280 and A260/A230 ranged from 1.99 to 2.03 and from 2.07 to 2.17, respectively This is indicative of a high RNA purity and the absence of contamination with polyphenolic, protein and polysaccharide compounds Conclusion: The high quality for RT-PCR reaction by two methods showed the extracted RNA can be used with assurance in downstream molecular techniques.