كلون سازي و بررسي بيان ژن nlpD اسينتوباكتر بوماني در سلول هاي HDF انسان به روش RT-PCR

Gene cloning and evaluation of the Acinetobacter baumannii nlpD gene expression in human dermal fibroblast cells using RT-PCR

سابقه و هدف: اسينتوباكتر بوماني يكي از باكتري­ هاي بسيار مقاوم در برابر انواع آنتي­ بيوتيك ­ها در جهان است. اين باكتري عامل عفونت­ هاي بيمارستاني به صورت بومي يا همه­ گير بوده و هنوز واكسن موثري عليه آن وجود ندارد. NlpD يكي از عوامل آنتي­ ژني مهم است كه سبب تحريك سيستم ايمني ميزبان مي­ گردد. بنابراين، هدف از اين تحقيق، كلون­سازي و بررسي بيان ژن nlpD باكتري اسينتوباكتر بوماني در سلول­ هاي HDF (Human dermal fibroblast) است. مواد و روش­ ها: در اين تحقيق تجربي ژن nlpD از روي ژنوم اسينتوباكتر بوماني با استفاده از روش PCR تكثير شد. سپس، ژن مذكور به­ ترتيب در ناقل ­هاي pTZ57R/T و pIRES2-EGFP كلون­ سازي و ساب­ كلون گرديد. تاييد صحت كلون­ سازي ژن با سه روش PCR، آنزيم ­هاي برش دهنده و تعيين توالي مورد ارزيابي قرار گرفت. سپس، ناقل نوتركيب نهايي pIRES2-EGFP-nlpD با كمك الكتروپوريشن به سلول­ هاي HDF منتقل گرديد و بيان ژن هدف در اين سلول­ ها با روش RT-PCR بررسي شد. نتايج: قطعه 831 جفت بازي مربوط به ژن nlpD اسينتوباكتر بوماني با موفقيت تكثير شد. هم­ چنين، نتايج تحقيق نشان داد كه سازواره نهايي pIRES2-EGFP-nlpD تشكيل گريده است. مشاهده باند 831 جفت بازي پس از انجام RT-PCR، در سلول­ هاي ترانسفورم شده نسبت به سلول­ هاي شاهد، مويد بيان ژن nlpD در سلول­ هايHDF مي­ باشد. نتيجه ­گيري: سازواره نهايي ساخته شده در اين تحقيق توان بيان ژن nlpD اسينتوباكتر بوماني را در سلول­ هاي يوكاريوتي دارد. بيان موفق ژن هدف مي­ تواند در راستاي بررسي ايمني­ زايي در حيوانات آزمايشگاهي به­ عنوان يك واكسن نوتركيب مدنظر قرار گيرد. هم­ چنين، سازواره pIRES2-EGFP-nlpD از پتانسيل لازم براي بررسي به ­عنوان واكسن ژني در تحقيقات آينده برخوردار است.

Background: Acinetobacter baumannii is one of the highly antibiotic-resistant bacteria in the world. This bacterium is a cause of endemic and epidemic nosocomial infections and despite many efforts, there is still no effective vaccine agains it. NlpD is one of the important antigenic agents that stimulate the immune system. So, the aim of this study was to examine gene cloning and expression of the nlpD gene of A. baumannii in human dermal fibroblast (HDF) cells. Materials and Methods: In this experimental study, the nlpD gene was amplified from A. baumannii genome using polymerase chain reaction (PCR). Then, the nlpD gene was cloned and sub-cloned in pTZ57R/T and pIRES2-EGFP vectors, respectively. Confirmation of gene cloning was performed by PCR, restriction endonuclease and sequencing methods. The final pIRES2-EGFP-nlpD recombinant vector was transformed into HDF cells using electroporation and the expression of target gene was evaluated by RT-PCR. Results: In this study, the 831 bp nlpD gene of A. baumannii was amplified successfully. Also, the results of the study showed that the recombinant pIRES2-EGFP-nlpD final construct was produced. Observation of the 831 bp band on agarose gel in transformed cells compared to control cells confirmed the nlpD gene expression in HDF cells. Conclusion: The final construct that generates in this study can express the nlpD gene of A. baumannii in eukaryotic cells. Successful expression of the target gene can be used as a new recombinant vaccine in animal model. The pIRES2-EGFP-nlpD recombinant vector has also the potential as a gene vaccine for future research.