مقايسه دو روش ICC-RT-PCR و كشت سلولي به منظور تشخيص انتروويروس‌ها در نمونه‌هاي فاضلاب

A Comparative study of ICC-RT-PCR and Cell Culture methods for detection of Enteroviruses in Sewage

سابقه و هدف: انتروويروس‌ها يكي از مهم‌ترين ويروس‌هاي روده‌اي هستند كه طيف وسيعي از بيماري‌ها را در انسان ايجاد مي كند. اخيرا با توجه به زمان‌بر بودن و همچنين نياز به انجام تست‌هاي تاييدي، استفاده از روش‌هاي مولكولي جهت تشخيص انتروويروس‌ها مورد توجه قرار گرفته است. هدف از اين پژوهش ارزيابي روش‌هاي ICC-RT-PCR و كشت سلولي براي تشخيص انتروويروس‌هاي موجود در سيستم فاضلاب است. مواد و روش‌ها: در اين پژوهش 63 نمونه فاضلاب با روش Grab sample تهيه و با روش‌هاي Pellet و Two-Phase تغليظ و در رده‌هاي سلولي RD و HEp-2 كشت داده شد. در مرحله بعد، تمامي نمونه‌ها به كشت‌هاي سلولي حساس RD و HEp-2 تلقيح و پس از 24 ساعت گرمخانه گذاري در حرارت 36 درجه سانتي‌گراد، با استفاده از پرايمرهاي Pan E.V، Pan P.V و پرايمرهاي اختصاصي Sabin بر روي نمونه‌هاي كشت سلولي تست RT-PCR انجام شد. يافته‌ها: از مجموع نمونه‌هاي مورد بررسي، با استفاده از روش كشت سلولي از 33 نمونه انتروويروس (52/38 درصد) و توسط روش ICC-RT-PCR از 41 نمونه انتروويروس (65/07درصد) و از 6 نمونه ويروس پوليو (9/52 درصد) جداسازي گرديد. نتيجه‌گيري: با آناليز آماري مشخص شد كه بين روش‌هاي كشت سلولي و ICC-RT-PCR ارتباط معني داري در سطح 0/05 براي جداسازي انتروويروس‌ها وجود دارد. همچنين حساسيت روش ICC-RT-PCR براي تشخيص انتروويروس‌ها كمتر از 0/01، TCID50 ارزيابي شد كه مي‌تواند نشان دهنده قابل قبول بودن و حساسيت اين روش براي تشخيص انتروويروس‌هاي موجود در فاضلاب باشد.

Background and objectives: Enteroviruses are one of the most important enteric viruses which produce a broad range of human diseases. But being time consuming and also the necessity to perform confirmed tests for Enteroviruses detection, using molecular direct methods have been recently considered. The aim of this research is evaluation of ICC-RT-PCR and cell culture methods for detection of enteroviruses in sewage system. Materials and methods: In this research 63 specimens were provided through Grab sample method which concentrated by pellet & Two-phase method and cultured in RD and HEp-2 cells respectively. All specimens, then, were inoculated using sensitive cell cultures of RD and HEp-2. After 24 hours incubation at 360C by means of Pan E.V primers and afterwards Pan P.V Primers along with specific sabin primers, test of RT-PCR was carried out on the cell culture specimens. Results: Out of all collected specimens, enteroviruses were isolated from 33 specimens (52.38%) and 41(65.01%) specimens which utilized cell-culture & ICC-RT-PCR methods respectively. Polioviruses were also isolated from 6 specimens. Conclusion: Statistical analysis indicated that there is a significant relationship (P= 0.05) between cell culture and ICC-RT-PCR methods for isolating enteroviruses. Further the sensitivity of ICC-RTPCR method to detect enteroviruses less than 0.01 TCID50 was evaluated, which can indicated the acceptability and sensitivity of this method for detection of enteroviruses in sewages.