توليد پلي‌هيدروكسي‌بوتيرات با استفاده از عصارۀ آنزيمي آزوسپريلوم‌برازيلنس در محيط عاري از سلول

Synthesis of poly(3-hydroxybutyrate) using enzymes Azospirillum brasilense in vitro

مقدمه: پلي‌هيدروكسي‌آلكانوات‌ها (PHAS) پليمرهاي باكتريايي هستند كه معمولاً به‌عنوان پلي‌استر ذخيره‌اي توسط طيف گسترده‌اي از ميكروارگانيسم‌ها تحت شرايط عدم‌تعادل مواد غذايي ساخته مي‌شوند و خواص مكانيكي پلي‌هيدروكسي‌آلكانوات‌ها آنها را جهت جايگزيني با پلاستيك‌هاي توليدشده از مواد پتروشيمي مشابه مناسب ساخته است.؛اما برخلاف پلاستيك‌هاي رايج در طبيعت به‌طور كامل به CO2 و H2O تبديل مي‌شود. PHA مي‌تواند به‌وسيلۀ روش‌هاي بيوتكنولوژي تحت شرايط كنترل‌شده توليد شود. مواد و روش ها: ابتدا يك سوسپانسيون ميكروبي غني از PHB آماده شد و پس از شكستن سلول‌ها و اطمينان از نبودِ سلول زنده، به محيط حداقل يا محيط M9 اضافه شد. سپس كدورت نمونه در طول‌موج 600 نانومتر اندازه‌گيري شد و انكوباسيون در 30 درجه سلسيوس و rpm 120 صورت گرفت. بعد از طي مدت‌زمان تعيين‌شده كدورت محلول و ميزان PHB موجود در محيط اندازه‌گيري شد و از مقدار شاهد كسر گرديد. ميزان گلوكز محيط نيز اندازه‌گيري شد؛ سپس روي نمونۀ PHB استخراج‌شده آناليزهاي فيزيكي و شيميايي جذب UV، FTIR، HPLC و HNMR1 انجام شد و با نمونۀ استاندارد مقايسه گرديد. نتايج: در آزمايش‌هاي انجام‌شده در دوازده روز متوالي از روز سوم ميزان پلي‌هيدروكسي‌بوتيرات قابلِ‌اندازه‌گيري بود. و در روز دهم بيشترين مقدار پلي‌هيدروكسي‌بوتيرات كه 0/3 گرم در صد بود حاصل شد و بعد از آن ميزان پلي‌هيدروكسي‌بوتيرات ثابت ماند. در ضمن ميزان قند نمونه هر روز كاهش پيدا مي‌كرد و در روز دهم به مقدار 0/2 گرم‌برليتر رسيد، آناليز فيزيكوشيميايي نيز توليد پلي‌هيدروكسي‌بوتيرات را تأييد كرد. بحث و نتيجه گيري: در اين پژوهش آزمايش با استفاده از كليۀ آنزيم‌هاي باكتري در خارج از سلول انجام گرفت با توجه به نتايج به‌دست‌آمده در اين پژوهش بازده واكنش 37/5 درصد است كه با خالص‌سازي آنزيم و استفاده از سوبستراي اختصاصي و بهينه‌كردن شرايط آنزيم مي‌توان توليد PHB را به‌طور مستمر در خارج از سلول ادامه داد.

Introduction: Polyhydroxyalkaniates (PHAS) are bacterial polymers that are formed as naturally occurring storage polyesters by a wide range of microorganisms usually under unbalanced growth conditions. Mechanical properties of PHAS make them suitable replacements for petrochemically produced bulk plastics (polyethylene, polypropylene etc.), but in contrast to these commodity plastics PHA are completely degradable to carbon dioxide and water through natural microbiological mineralization. PHAS can be produced by biotechnological processes under controlled conditions. Polyhydroxybotyric acid (PHB) was the first of the PHAS discovered and is the most abundant polyester found in bacteria. Materials and methods: First, a rich bacterial suspension prepared from poly(3-hydroxybutyrate), then the cells were broken down and ensure the absence of live cells. The cell free enzymes were added to M9 medium. Then the sample turbidity was measured at a wavelength of 600 nm and incubated at 30°C and centrifiuged at 12orpm. Next, the amount of PHB as well as solution turbidity were measured and compared with control. The physical and chemical analyzes of extracted PHB samples such as UV absorbtion, FTIR, HPLC and HNMR assesed and compared with standard sample. Results: In twelve days this experiment was conducted, from the third day, the amount of polyhydroxybutyrate was measurable and the highest polyhydroxybutyrate was gained on the tenth day. The level of PHB was constant. Moreover, the level of glucose was decreased gradually till the tenth day. By Physico-chemical analysis, production of polyhydroxybutyrate was approved. Discussion and conclusion: In this experiment, the reaction efficiency was 37.5 percent. Probably the rest of glucose could be changed to other intermediate compounds by other enzymes in the sample. Therefore, by purification of the enzyme, usage of specific substrate and optimization of conditions outside the cell could help the production of polyhydroxybutyrate continually. Production is very cost-effective, by this method.