خالص‌سازي آنزيم لاكاز قارچ Trametes و تعيين خصوصيات فيزيكوشيميايي لاكاز نوتركيب: يك مطالعه آزمايشگاهي

Purification of Fungal Laccase from Trametes and Characterization of Recombinant Laccase Physicochemical Properties: A Laboratory Study

زمينه و هدف: لاكازها يكي از اصلي ترين پروتين‌ها با قابليت كاتاليز اكسيداسيون تركيبات فنولي مي‌باشند كه به­عنوان بيوكاتاليست در بيوتكنولوژي جهت رنگ بري و رنگ زدايي در صنايع رنگ، سم‌زدايي در محيط زيست، شفاف‌سازي آب ميوه‌ها در صنايع غذايي كاربرد دارند. هدف از اين پژوهش، توليد لاكاز نوتركيب، خالص‌سازي با بازده بالا و تعيين خصوصيات بيوشيميايي و كينتيكي لاكاز تخليص شده مي‌باشد. مواد و روش‌ها: در اين مطالعه آزمايشگاهي، لاكاز نوتركيب قارج ترامتوس كه در ميزبان مخمري به شكل خارج سلولي، بيان شده است. طي چندين مرحله با استفاده از روش‌هاي اولترافيلتريزاسيون و كروماتوگرافي به روش ژل فيلتريزاسيون تخليص شد و كارآيي روند تخليص تعيين و پس از تعيين وزن مولكولي، خصوصيات فيزيكوشيميايي لاكاز نوتركيب بررسي و ميزان پايداري حرارتي آنزيم تعيين شد. تمامي آزمون‌ها با انجام حداقل 3 تكرار و احتساب ميانگين و انحراف از معيار انجام گرديد. يافته‌ها: نتايج نشان داد لاكاز با موفقيت و بازده 5/67 برابر با حفظ 49/7 درصد فعاليت آنزيمي تخليص شد و وزن مولكولي لاكاز نوتركيب 65 كيلو­دالتون تعيين شد. دما و pH بهينه لاكاز تخليص شده به ترتيب C°60 و 4/8 تعيين شد. خصوصيات كينتيكي آن نيز تعيين شد. بررسي پايداري دمايي لاكاز نوتركيب نشان داد كه لاكاز پايداري بالايي در برابر حرارت دارد. نتيجه‌گيري: نتايج نشان داد كه روش كروماتوگرافي ژل مي‌تواند روشي كارآمد جهت خالص‌سازي لاكاز نوتركيب با حفظ خصوصيات آنزيمي و پايداري حرارتي بالا باشد، به­طوري­كه لاكاز نوتركيب تخليص شده با بازده بالا و حفظ فعاليت مي‌تواند در صنايع دارويي، نساجي، محيط زيست و غذايي و سم‌زدايي محيط زيست، كاربرد داشته باشد.

Background and Objectives: Laccase is the most abundant member of protein family that catalyzes the oxidation of substituted phenols. Laccases are used as biocatalysts for decolorization and bleaching in dye industries, detoxification in environment, and juice clarification in food industries. The present study aimed at producing recombinant laccase, purifying with high yield and fold, and characterizing biochemical and kinetic properties of the purified laccase. Materials and Methods: In this laboratory study, recombinant Trametes laccase, which was successfully expressed in yeast host in extracellular form, was purified through ultrafiltration and gel chromatography methods. The purification process yield and fold was determined and after molecular weight determination, physiochemical properties of recombinant laccase were studied and its thermostability was determined. All tests were conducted with at least 3 times repetition and mean and standard deviation calculation. Results: Purification strategy showed that laccase was successfully purified with 5.67 fold and 49.7% yield and the molecular weight of recombinant laccase was determined 65KDa. Optimum pH and temperature of the recombinant laccase were determined 4.8 and 60°C, respectively. Its kinetic properties were also determined. The thermostability assessment showed that purified laccase is highly thermostable. Conclusion: The results indicated that gel chromatography purification method can be an ideal to achieve high yield and fold purification of recombinant laccase with keeping enzyme properties and high thermostability, so that the recombinant purified laccase with high yield and fold can be used in drug, textile, and food industries, and environment and its detoxification.