ارزيابي روش Real-time PCR Multiplex به‌منظور شناسايي گونه‌هاي شايع باكتري بروسلا

Evaluation of Multiplex Real-time Polymerase Chain Reaction in Detecting Common Species of Brucella

سابقه و هدف: بيماري بروسلوز يك بيماري مشترك انسان و دام است. با توجه به ويژگي‌هايي مانند سخت رشد بودن، خطرات مرتبط با كشت و وجود واكنش‌هاي متقاطع با باكتري‌هاي ديگر در آزمون سرولوژيك، در مطالعه حاضر روش Real-time PCR Multiplex به‌منظور شناسايي گونه‌هاي شايع باكتري بروسلا (Brucella) ارزيابي شد. مواد و روش‌ها: اين مطالعه تجربي در دانشگاه علوم پزشكي همدان و در سال 1394 در دو مرحله بيوانفورماتيكي و آناليتيكي صورت گرفت. در مطالعه حاضر، يك پرايمر همگاني براي شناسايي همه‌ي گونه‌هاي جنس بروسلا و دو پرايمر اختصاصي ديگر براي گونه‌هاي بروسلا ملي‌تنسيس (B. melitensis) و بروسلا آبورتوس (B. abortus) كه بيشترين شيوع را دارند، طراحي شد. ژن‌هاي ITS، BMEII-0466 و BruAB2-0168 به‌عنوان ژن‌هاي هدف به‌ترتيب براي جنس بروسلا، بروسلا ملي‌تنسيس و بروسلا آبورتوس انتخاب گرديدند. اختصاصيت و حساسيت پرايمرها نيز در مرحله آناليتيكي ارزيابي شدند. يافته‌ها: پرايمر همگاني، جنس بروسلا را در 83 جفت باز و دماي ذوب معادل 82/5 درجه سانتي‌گراد شناسايي مي‌كند. به‌طور اختصاصي، پرايمرهاي بروسلا ملي‌تنسيس و بروسلا آبورتوس به‌ترتيب در 121 و 285 جفت باز و دماهاي ذوب معادل 84 و 87 درجه سانتي‌گراد، اين باكتري‌ها را شناسايي مي‌كنند. حساسيت به‌دست ‌آمده براي پرايمر همگاني و بروسلا آبورتوس، fg 50 و براي بروسلا ملي‌تنسيس fg 100 بود. استنتاج: با توجه به نتايج به‌دست‌ آمده توسط اين مطالعه، پرايمرهاي طراحي‌شده حساسيت و اختصاصيت قابل‌قبول و بالايي از خود نشان دادند كه مي‌توان براي ارزيابي آن‌ها در آزمايش‌هاي كلينيكي به همراه روش كشت استفاده كرد.

Background and purpose: Brucellosis is a zoonotic disease. Given that serologic test has some specific characteristics such as difficult growth, problems associated with culture, and cross-reactions with otherbacteria, in this study multiplex real-time polymerase chain reaction (PCR) method was used to detect the most common species of Brucella spp. Materials and methods: This experimental study was performed in Hamedan University of Medical Sciences, Hamedan, Iran, 2015, in two bioinformatical and analytical stages. A universal primer was designed to detect Brucella genus and two primers were prepared for B. melitensis and B. abortus, which are the most common species. The target genes for universal Brucella, B. melitensis, and B. abortus primers were ITS, BMEII-0466, and BruAB2-0168, respectively. In the analytical stage, specificity and sensitivity of the primers were evaluated. Results: In this study, the universal primer of Brucella was detected in 83 bp at melt temperature of 82∘C. Moreover, B. melitensis and B. abortus primers were specifically identified in 121 bp and 285 bp at melt tempretures of 84∘C and 87∘C, respectively. The sensitivity for the universal Brucella primer and B. abortus was 50 fg, while it was 100 fg for the B. melitensis primer. Conclusion: The identified primers revealed high levels of sensitivity and specificity. Therefore, they can be considered along with culture in clinical trials.