تاثير ويتامين ث بر القاء كلوني‌زايي سلول‌هاي بنيادي اسپرماتوگوني گوسفند در محيط آزمايشگاه

Effect of vitamin C on colony formation of ovine spermatogonial stem cells in vitro

زمينه و هدف: تكنولوژي استفاده از سلول­هاي بنيادي به دليل عدم وجود يك سيستم كشت ايده ­آل براي رشد و تكثير اين سلول­ها محدود شده است. هدف از اين مطالعه بررسي اثر غلظت­ هاي مختلف ويتامين ث بر القاء كلوني­ زايي اين سلول­ها در محيط كشت است. روش بررسي: سلول­هاي اسپرماتوگوني بيضه­ بره­ نابالغ طي دو مرحله هضم آنزيمي جدا و به روش حذف تمايزي خالص ­سازي شدند. اين سلول­ها به مدت 10 روز به چهار روش تيمار شدند: گروه شاهد شامل كشت ساده سلول­هاي اسپرماتوگوني در محيط DMEM حاوي 1 درصد آنتي­ بيوتيك و 5 درصد FBS و تيمارهاي 1، 2 و 3 شامل محيط بالا و به ترتيب 20، 40 و 60 ميكروگرم بر ميلي­ ليتر ويتامين ث بود. تعويض محيط كشت هر 3 روز انجام شد و تعداد و قطر كلوني­ هاي تشكيل شده در روزهاي 4، 7 و 10 پس از كشت به وسيله­ ميكروسكوپ معكوس بررسي گرديد. شناسايي سلول‌ها با رنگ‌آميزي ايمنوسيتوشيمي عليه PGP9.5 انجام شد. يافته‌هاي حاصل از پنج بار تكرار با استفاده از نرم افزار R و آزمون آماري آناليز واريانس مورد بررسي قرار گرفت و 0/05>p بعنوان سطح معني‌داري تعيين گرديد. يافته ها: مساحت كلوني­ هاي اسپرماتوگوني در روز 7 در تيمار 2 (0/41) اختلاف معني­داري با تيمار 3 (0/08) داشت (0/05>P). همچنين مساحت كلوني­ها در روز 10 كشت در تيمار 2 با ديگر گروه‌ها اختلاف معني­دار داشت (0/05>P). نتيجه گيري: نتايج حاصل از اين مطالعه نشان مي­دهد كه ويتامين ث در دوز 40 ميكروگرم بر ميلي ­ليتر داراي تاثير مثبت افزايشي بر مساحت كلوني ­هاي اسپرماتوگوني است ، اما روي تعداد سلول­هاي اسپرماتوگوني بي تاثير است.

Background and Aim: The technology of using spermatogonial stem cells (SSCs) has been limited due to lack of an ideal culture system for growth and proliferation. The aim of this study was to investigate the effects of different doses of vitamin C on SSCs colony formation in vitro. Materials and Methods: The cells were isolated from testes of prepubertal lambs by two enzymatic digestions, purified by differential platting, and then treated for 10 days by using 4 methods: Simple culture including SSCs in DMEM containing 1% antibiotic and 5% FBS as our control group and for the three other cultures we used the same culture medium as that in control group plus 20, 40 and 60 µg/ml of vitamin C respectively. Culture media were refreshed every 72h and colony numbers and diameters were determined on the 4th , 7th and 10th days after the beginning of culture by using inverted microscope. Spermatogonial cells were identified by immunocytochemistry staining against PGP9.5. Using R software, the results obtained from 5 repeats were evaluated by ANOVA. P<0.05 was considered significant. Results: On the 7th day, we found a significant difference between the culture No. 2 (0.41 mm2) and culture No. 3 (0.08 mm2) in regard to spermatogonial colonies surface areas (P<0.05). Also, colonies surface areas on the 10th day in the culture No. 2 was significantly greater than those in the other groups (P<0.05). Conclusion: The results of this study showed that vitamin C with a dose of 40 (μg/ml) was effective in increasing the surface area of spermatogonial colonies. But it had no effect on spermatogonial cell number.