طراحي و ساخت حامل لنتي ويروسي بيان كننده miRNA-499a و انتقال آن‌ به سلول ‌هاي بنيادي مزانشيمي انسان

Designing and Constructing the Lentiviral Vector Coding miRNA- 499a and Transduction of Human Mesenchymal Stem Cells

سابقه و هدف: وكتورهاي لنتي‌‌ويروسي حامل‌هاي مناسبي براي انتقال ژن به سلول‌ها بوده و مي‌توانند سبب بيان بالا و مداوم ژن‌‌ها در سلول‌هاي ميزبان شوند. ريز RNA ها (miRNAs )، گروهي از RNA هاي غير كد‌كننده كوچك هستند كه بيان ژن را پس از رونويسي از طريق مهار ترجمه يا القاء تجزيه mRNA كنترل مي‌كنند و از اين طريق فرآيند‌‌هاي زيستي متعددي از جمله تمايز سلولي را تنظيم مي‌‌نمايند. مطالعاتي نشان داده‌اند كه miRNA-499a در تمايز سلول‌هاي بنيادي به سلول‌هاي قلبي نقش دارد. با توجه به مطالب ذكر شده، در اين مطالعه ساخت وكتور لنتي‌‌ويروسي ناقل miRNA-499a جهت استفاده در تمايز سلول‌‌هاي قلبي مورد بررسي قرار گرفت. مواد و روش‌ها: رشته‌‌هاي p3 و p5 مربوط به miRNA-499a طراحي و ساخته شده و در پلاسميد ويژه‌‌اي كلون شدند. براي اطمينان از ورود صحيح اين رشته‌هاي نوكلئوتيدي، هضم آنزيمي و توالي‌‌يابي انجام گرديد. سپس ذرات لنتي‌ويروسي حامل رشته‌‌هاي miRNA-499a-3p و p5miRNA-499a- ساخته شدند و براي ترانس‌‌داكشن سلول‌هاي مزانشيمي مغز استخوان انسان مورد استفاده قرار گرفتند. يافته‌ها: نتايج حاصل از هضم آنزيمي و توالي‌‌يابي، كلون شدن صحيح رشته‌‌هاي p3 و p5 مربوط به miRNA-499a به داخل پلاسميد را نشان دادند. بيان بالاي eGFP نشان دهنده كارايي بالاي ترانس‌‌فكشن و ترانس‌داكشن بود. ويروس‌‌هاي حامل رشته‌‌هاي miRNA-499a-3p/5p ساخته شده، توانستند سبب ترانس‌داكشن سلول‌‌هاي بنيادي مزانشيمي گردند. استنتاج: در اين مطالعه حامل‌‌هاي لنتي‌ويروسي ناقل miRNA-499a-3p/5p توليد شدند، كه با توجه به ميزان مناسب ترانس‌‌داكشن سلول‌‌هاي بنيادي مزانشيمي، مي‌توانند در تمايز اين سلول‌‌ها به سلول‌‌هاي قلبي مورد استفاده قرار گيرند.

Background and purpose: Lentiviral vectors (LVs) are suitable candidates for gene delivery to cells with stable and high-level of transgene expression in target cells. MicroRNAs (miRNAs, miRs) are non-protein coding, short (~22 nucleotides) and single-stranded RNAs that act as post-transcriptional regulators of gene expression, and are involved in various cellular processes, including proliferation, differentiation and apoptosis. Several studies have shown that miR-499a promotes cardiac differentiation in cardiac stem cells. So, the aim of our study was to construct lentiviruses carrying miRNA-499a. Materials and methods: Specific sequences of miRNA-499a (3p and 5p) were designed and constructed. Then, miRNA-499a was cloned into lentiviral vector. Analytical digestion and nucleotide sequence analysis were performed to ensure successful introduction of the miRNA to the vector. Then, the lentiviral particles produced (miRNA-499a-3p and miRNA-499a-5p) were used for transduction of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hBM-MSCs). Results: Analytical digestion and sequence analysis confirmed the accuracy of the constructs. The high expression of eGFP represented the high efficiency of transfection and transduction. The lentiviral particles carrying miRNA-499a-3p/5p were made and could transduce hBM-MSCs. Conclusion: In this study we made lentiviral particles carrying miR-499a that could be used for differentiation of stem cells to cardiomyocytes.