تاثير محيط كشت پايه، سرم جنين گاو (FBS) و دما بر كشت سلول هاي فوليكولي تاسماهي استرلياد Acipenser ruthenus Linnaeus, 1758

Effect of culture media, fetal bovine serum (FBS) and temperature on ovarian follicular cell in Sterlet sturgeon Acipenser ruthenus Linnaeus, 1758

در اين تحقيق پس از بيهوش نمودن يك عدد تاسماهي استرلياد ماده پرورشي 6 ساله به وزن 729 گرم و طول 47/3 سانتي متر و با استفاده از پودر گل ميخك (0/4 گرم در ليتر)، قسمتي از تخمدان خارج شد. تخمك ها از يكديگر جدا شدند و پس از شستشو با بافر PBS استريل حاوي آنتي بيوتيك ها، سلول هاي فوليكولي از طريق تيمار تخمك ها با Trypsin-EDTA درصد 0/25 حل شده در PBS عاري از يون هاي كلسيم و منيزيوم جدا شدند و در محيط كشت L-15 داراي 20 درصد سرم جنين گاو (FBS) و آنتي بيوتيك ها در دماي 22 درجه سانتي گراد كشت داده شدند (clls/ml 106×1/25). پس از دوازده روز، زماني كه به مقدار كافي يك لايه سلولي روي كف فلاسك كشت تشكيل شد، سلول ها با استفاده از Trypsin-EDTA درصد 0/25 از كف فلاسك جدا شدند و با PBS حاوي آنتي بيوتيك ها شستشو و كشت داده شدند. در اين تحقيق از محيط كشت هاي L-15، DMEM/F12 و M199، غلظت هاي 10، 15 و 20 درصد سرم جنين گاو و دماهاي 20، 22 و 25 درجه‌ سانتيگراد استفاده شد. سلول ها در محيط كشت L-15 تكثير خوبي را نشان دادند ولي در محيط كشت هاي ديگر تكثيري مشاهده نشد و در دماهاي 20 و 22 درجه سانتي گراد توانستند تكثير يابند كه دماي 22 درجه ايده‌آل بود. همچنين ميزان تكثير سلول هاي فوليكولي زماني كه مقدار FBS محيط كشت از 10 درصد به 20 درصد رسيد، افزايش يافت. بهترين تكثير در غلظت 20 درصد FBS مشاهده شد. بيشترين تكثير سلولي در محيط كشت L-15 داراي 20 درصد FBS و دماي انكوباسيون 22 درجه سانتيگراد بدست آمد.

In the present study, a piece of the ovary of a 6 years old female Sterlet sturgeon (A. ruthenus), a farmed fish (729 g and 47.3 cm), was removed after anaesthetizing with clove carpel powder (0.4 g/lit). Ovarian follicles were isolated from each other and were washed using sterile phosphate-buffered saline (PBS) containing antibiotics. Follicular cells were then separated by treating oocytes with 0.25% Trypsin-EDTA in Ca2+ and Mg2+ free PBS and were cultured in medium L-15 supplemented with 20% FBS at 22°C (1.25×106cells/ml). After twelve days, when confluent monolayer cells covered the bottom surface of the flask, the cells were dislodged by Trypsin-EDTA solution (0.25%), and were then washed with PBS containing antibiotics and sub-cultured. In the experiments, ovarian follicular cell were cultured in L-15, DMEM/F12 and M199 media, 10%, 15% and 20% of FBS, and were incubated at 20°C, 22°C and 25°C. Cells in L-15 showed better growth but no cell growth observed in the other media. The cells could grow at temperature between 20°C and 22°C, and the results showed that the optimum temperature for cell growth was 22°C. In addition, the growth rate of follicular cells increased when the FBS proportion increased from 10% to 20%, with the optimal growth at the concentrations of 20% FBS. Most proliferation of cells obtained when the L-15 medium was supplemented with 20% FBS and the incubation temperature was 22°C. The most proliferation of cells obtained in L-15 medium with 20% FBS at 22°C.