مطالعه ساختار ژن دفنسين (Def2) گياه شنبليله (Trogonella foenum-graecum) با استفاده از فرم DNA ژنومي و cDNA

Structural Analysis of Def2 Gene from Trigonella foenum-graecum by Characterization of Its Genomic and cDNA

دفنسين­ ها كه جزء خانواده پپتيدي با وزن مولكولي پايين و غني از سيستئين مي‌باشند يك گروه غالب از پروتئين‌هاي عمل‌كننده غشايي را تشكيل مي‌دهند. اين پپتيدها در حفاظت از بذر گياهان در برابر عفونت‌هاي پاتوژن‌هاي قارچي نقش مهمي ايفا مي‌كنند. در اين تحقيق ژن 2Def از گياه شنبليله (Trigonella foenum-graecum) شناسايي، همسانه‌سازي و تعيين توالي گرديد. بدين‌منظور DNA ژنومي گياه شنبليله به روش CTAB استخراج و با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي MDeff و MDefr ژن 2Def تكثر شد. قطعه تكثير شده به طول مورد انتظار 750 جفت باز در ناقل pJET1.2 همسانه‌سازي شد. سازه به‌دست آمده پس از تأييد با الگوهاي هضم آنزيمي و PCR به نام pJETME3 نام‌گذاري شد. جهت مطالعه ساختار اين ژن، mRNA از جوانه ده روزه گياه شنبليله استخراج و cDNA آن سنتز شد. cDNA حاصل به طول مورد انتظار 219 جفت باز در ناقل pJET1.2 همسانه‌سازي و پس از تأييد با استفاده از الگوي هضم آنزيمي و PCR به نام pJETME4 نام‌گذاري شده و جهت تعيين توالي مورد استفاده قرار گرفت. مقايسه توالي DNA ژنومي و cDNA اين ژن نشان داد كه ژن 2Def گياه شنبليله حاوي يك اينترون به طول 486 جفت باز و Open reading frame آن پپتيدي به طول 72 اسيدآمينه را كد مي‌كند. مقايسه توالي اسيدآمينه اي به‌دست آمده از ژن 2Def از گياه شنبليله با توالي‌هاي مرتبط ثبت شده در بانك ژني مورد مقايسه قرارگرفت و مشابهتي بين 98/6 تا 100 درصد را نشان داد. از اين توالي ژني و cDNA تأييد شده مربوط به ژن Def2 مي‌توان در مراحل تحقيقاتي بعدي جهت انتقال به گياه كلزا به‌منظور افزايش مقاومت عليه بيماري‌هاي قارچي استفاده نمود.

Many antifungal peptides including defensins change the fungal membrane potential and ultimately lead to fungal cell death. In this study the genomic DNA from Trigonella foenum-graecum (extracted with CTAB method) and specific primers (MDef-F/R) were used for Def2 containing fragment amplification. The amplified DNA fragment with 750 bp length was cloned into pJET1.2 cloning vector, confirmed by PCR (MDef-F/R primers) and restriction pattern (using XbaI enzyme) and sequenced. Also Def2 cDNA was synthesized with 219 bp length and cloned into pJET1.2. The new construct was confirmed by PCR (MDef-F/R primers) and restriction pattern (using XbaI and XhoI enzymes) and sequenced. Comparison of genomic DNA and cDNA sequences showed that Def2 gene contains one intron with 486 bp length and its ORF codes for a polypeptide with a 72 amino acids length. Alignment of the amino acid sequence of Def2 peptide shows 98.8 to 100% homology with other reported plant defensin sequences deposited in GenBank. These confirmed that genomic DNA and cDNA of Def2 gene could be used for improvement of antifungal activity of Brassica napus.