بررسي تأثير ليپوپلي ساكاريد باكتريايي بر ساختار و ديناميك پليمريزاسيون توبولين هاي موشي

Study of the effect of bacterial lipopolysaccharide on the structure and dynamics on mouse tubulin polymerization

زمينه و هدف: در دهه هاي اخير مطالعات بسياري بر روي ديناميك پليمريزاسيون دايمرهاي توبوليني و نيز فاكتورهاي موثر بر آن انجام شده است. بر اساس مطالعات صورت گرفته، ليپوپلي ساكاريد (LPS) به صورت غيرمستقيم و از طريق مسيرهاي آنزيمي، با هايپرفسفريلاسيون پروتين تاو، انفصال آن از ميكروتوبول و در نهايت ناپايدارسازي شبكه هاي ميكروتوبولي، در القاء بيماري هاي تحليل برنده سيستم عصبي به خصوص آلزايمر نقش دارد. هدف از اين مطالعه، بررسي تأثير مستقيم LPS در شرايط in vitro بر ساختار و ديناميك پليمريزاسيون توبولين ها مي باشد. روش بررسي: در اين مطالعه، توبولين هاي موشي طي دو سيكل پليمريزاسيون/ دپليمريزاسيون و به دنبال آن عبور از ستون كروماتوگرافي سلولز فسفات تخليص شد. خلوص نمونه به دست آمده با استفاده از روش SDS-PAGE مورد ارزيابي قرار گرفت. تغيير در ساختارهاي دوم و سوم، و نيز ديناميك پليمريزاسيون توبولين در حضور غلظت هاي مختلف LPS (5 پيكومولار، 5 نانومولار، 50 نانومولار، 5/0 ميكرومولار و 5 ميكرومولار) به ترتيب با بهره گيري از تكنيك دورنگ نمايي دوراني (CD)، سنجش نشر فلورسانس ذاتي و كدورت سنجي مورد ارزيابي قرار گرفت. يافته ها: نتايج حاصل از SDS-PAGE خلوص دايمرهاي توبوليني را تأييد نمود. مطالعات دورنگ نمايي دوراني و نشر فلورسانس ذاتي، به ترتيب تغيير در ساختارهاي دوم و سوم توبولين را در حضور LPS نشان دادند. نتايج حاصل از مطالعه كدورت سنجي نيز تأثير LPS در كاهش پليمريزاسيون دايمرهاي توبوليني را نشان داد. نتيجه گيري: بر اساس مطالعه صورت گرفته LPS قادر است طي ميان كنش با دايمرهاي توبوليني و تغيير در ساختارهاي دوم و سوم، تمايل آن ها را براي برهمكنش با يكديگر و پليمريزاسيون كاهش مي دهد. بر اساس نتايج به دست آمده، به نظر مي رسد LPS علاوه بر اثرات غيرمستقيم خود در ناپايدارسازي شبكه هاي ميكروتوبولي، بتواند طي ميان كنش مستقيم با دايمرهاي توبوليني و اختلال در ديناميك پليمريزاسيون آن ها نيز در القاء بيماري هاي تحليل برنده سيستم عصبي به خصوص آلزايمر نقش ايفا كند.

Background and aims: In recent decades, there has been much research on the microtubule dynamics as well as on factors affecting it. According to different studies, lipopolysaccharide (LPS) is thought to play an indirect role in neurodegenerative diseases through enzymatic pathways which hyperphosphorylate Tau protein and dissociate it from microtubules. In the present study, it was aimed to assess the direct effect of LPS on the structure and dynamics of tubulin polymerization in vitro. Methods: In this study, mouse tubulins were purified through two cycles of temperature-dependent polymerization-depolymerization. Cellulose-phosphate chromatography was used to further purify tubulins. SDS-PAGE was used to analyze the purity of the tubulins. Circular dichroism (CD), intrinsic fluorescence and turbidity assays were used to assess the changes in secondary and tertiary structures, and the dynamics of tubulin polymerization in the presence of different concentrations of LPS (5pM, 5nM, 50nM, 0.5µM and 5µM), respectively. Results: SDS-PAGE analysis confirmed the purity of tubulins. The intrinsic fluorescence analysis and CD assay revealed the changes in the secondary and tertiary structures of tubulins in the presence of LPS. The results of turbidity assay indicated that LPS could reduce the polymerization of tubulins. Conclusion: Our results indicate that LPS is able to change the secondary and tertiary structures of tubulin and decreases tubulin polymerization. According to our results, lipopolysaccharide in addition to an indirect effect on the microtubules stability, as well as by decreases in tubulin polymerization could result in neurodegenerative diseases specially Alzheimer's diseases.