ايجاد دو واريانت از آنزيم EPSP synthase از طريق جهش زايي هدايت شده در موقعيت 96

آنزيم 5- انول پيروويل شيكيمات 3- فسفات سينتاز ( EPSPS ) مرحله ششم مسير شيكيمات را كه براي سنتز اسيدهاي آمينه و تركيبات حلقوي در جلبك ها، قارچ ها، باكتري ها و گياهان پيشرفته ضروري است كاتاليز مي كند. اين آنزيم محل اثر علف كش گلايفوسيت مي باشد كه عمل بازدارندگي خود را از طريق رقابت با فسفو انول پيرووات( PEP ) در محل اتصال آن با اين آنزيم اعمال مي كند. اسيدهاي آمينه متفاوتي در اين آنزيم تغيير داده شده اند كه هر كدام سطوح مقاومت متفاوتي را نسبت به گلايفوسيت نشان داده اند. يكي از اسيدهاي آمينه اي كه مورد مطالعه قرار گرفته اند گلايسين 96 مي باشد كه در جايگاه اتصال PEP به آنزيم قرار دارد. در اين مطالعه براي جايگزيني Gly96 با اسيدآمينه هاي آلانين (A) و والين(V) با استفاده از DNA ژنومي باكتري E.coli K12 ژن AroA مربوط به اين آنزيم را با واكنش زنجيره اي پليمراز(PCR) با پرايمرهاي اختصاصي داراي جايگاه برش Xba1 و Sma1 تكثير و در وكتور كلونينگpTZ57R/T همسانه سازي شد. براي ايجاد جهش هاي مورد نظر در ژن EPSPS از روش جهش زايي هدايت شده استفاده گرديد. دراين روش ابتدا با استفاده از پرايمر موتانت و يكي از پرايمرهاي اختصاصي ژن(P1) مگا پرايمر ايجاد و در مرحله بعد از مگاپرايمر به عنوان پرايمراختصاصي ژن استفاده و همراه با پرايمر اختصاصي دوم(P2) ، ژن جهش يافته با طول كامل تكثير شد. ژن هاي جهش يافته در داخل وكتور pTZ5R/T همسانه سازي شد. ژن هاي تيپ وحشي و جهش يافته پس از توالي يابي براي تراريزش گياه برنج در پلاسميد بياني pPZPY122 همسانه سازي گرديد.