مطالعه بيوانفورماتيكي پيوسين نوع S از سودوموناس آئروجينوزا و بيان دگرساخت آن در اشريشياكلي

A bioinformatics study of S-type pyocin from Pseudomonas aeruginosa and its heterologous expression in Escherichia coli

پيوسين­ها تركيبات ضد­ميكروبي هستند كه توسط جدايه­هاي مختلف سودوموناس آئروجينوزا توليد مي­شوند. در پژوهش حاضر، مطالعه In silico و بيان دگرساخت پيوسين نوع S از سودوموناس آئروجينوزا انجام گرفت. در ابتدا توالي ژن پيوسين نوع S بررسي، و سپس ويژگي­هاي بيوشيميايي پروتئين، ساختارهاي دوم و سوم آن به كمك ابزارهاي بيوانفورماتيك مورد ارزيابي قرار گرفت. به­دليل سميت بالقوه پيوسين­هاي نوع S در سلول­هاي توليدكننده و براي افزايش ميزان بيان آن، پيوسين و پروتئين ايمني مرتبط با آن به طور همزمان در اشريشياكلي BL21(DE3) بيان­شد. با استفاده از جفت آغازگرهاي اختصاصي، ژن پيوسين نوع S به همراه بخش ايمني مربوطه به­وسيله­ي PCR از ژنوم باكتري جدا شد. پس از هضم آنزيمي آن به­وسيله­ي آنزيم­هاي EcoRI و XhoI، در ناقل pET28a همسانه­سازي ­گرديد. پروتئين دگرساخت توسط القاگر IPTG در سلول اشريشياكلي BL21DE3 بيان و با استفاده از 12% SDS-PAGE وزن مولكولي آن تعيين گرديد. تخليص پروتئين با كمك كروماتوگرافي ميل تركيبيNi-NTA انجام گرفت. پيوسين نوع S داراي 1857 نوكلئوتيد و 618 اسيدآمينه، وزن مولكولي 65 كيلودالتون است. درصد بالاي مارپيچ آلفا در ساختار نشان دهنده پايداري پروتئين در برابر حرارت است كه با مقادير بالاي شاخص آليفاتيك مطابقت دارد. مدل سه­بعدي پيش­­بيني­شده توسط AlphaFold2، به عنوان بهترين ساختار انتخاب شد. شباهت تواليDNA پيوسين جدا شده در اينجا به پيوسين نوع S با استفاده از توالي­يابي تاييد و بررسي ژل SDS-PAGE، بيان پروتئين با وزن 65كيلودالتون را نشان داد. ارزيابي عملكرد پروتئين نوتركيب مورد مطالعه در حال انجام است.

Pyocins, a class of antimicrobial compounds, are produced by various isolates of P. aeruginosa. This research performed an in silico study and heterologous expression of the S-type pyocin from P. aeruginosa. Using bioinformatics tools, the gene encoding the S-type pyocin sequence from P. aeruginosa was evaluated for the protein s biochemical characteristics, secondary structure, and third structure. The pyocin and its immunity protein were co-expressed in Escherichia coli BL21DE3 to overcome the potential toxicity of S-type pyocins, enhancing its yield. The S-type pyocin gene and its immunity gene were isolated from the bacterial genome using specific primers and cloned into the pET28a via EcoRI and XhoI, generating the clone pYYS1. The S-type pyocin gene was induced in E. coli BL21DE3 using IPTG. SDS-PAGE analyses confirmed the expression. The heterologous protein was purified using Ni-NTA affinity column chromatography. The S-type pyocin sequence contains 1857 nucleotides and 618 amino acids; with a molecular weight of 65 kD. The high percentage of alpha helices indicates the protein s thermal stability, consistent with the high aliphatic index. The 3D model predicted by AlphaFold2 was selected as the optimum structure. DNA sequencing confirmed the sequence of the pyocin in the clone of pYYS1. SDS-PAGE analysis revealed the expression of a 65 kD protein in weight. Surveying the function of S-type pyocin heterologous protein is under processing.