نقش بيان نوتركيب آسپارتات سمي آلدئيد دهيدروژناز بر ميزان ترشح ترئونين

Role of recombinant expression of aspartate semialdehyde dehydrogenase in threonine production

ترئونين يكي از اسيدهاي آمينه ضروري در پستانداران بوده كه در زيست فناوري نيز اين اسيد آمينه نقش محوري در صنايع دارويي، غذايي و به ويژه خوراك دام ايفا مي­كند. امروزه در صنعت از سويه هاي دست ورزي شده اشرشيا كولي جهت توليد اين اسيد آمينه مهم استفاده مي شود. مسير بيوسنتز اين اسيد آمينه از آسپارتات شامل پنج مرحله آنزيمي است كه يكي از كليدي‌ترين آن‌ها، آنزيم آسپارتات سمي آلدهيد دهيدروژناز است. در اين پژوهش، ابتدا با استفاده از ابزارهاي بيوانفورماتيكي پرايمرهايي اختصاصي ژن asd به همراه جايگاه برش آنزيم هاي محدود كننده مورد نظر طراحي و سفارش داده شد. در مرحله بعد ژن آنزيم از طريق PCR تكثير گرديد و پس از هضم آنزيمي و ليگاسيون وارد وكتور بياني pET-21a گرديد. پس از آن، سلول‌هاي مستعد Escherichia coli توسط پلاسميد نوتركيب تهيه شده تراريخت گرديد. در نهايت ميزان ترئونين در محيط كشت فقير به روش نين هيدرين اندازه‌گيري گرديد و ميزان ترئونين توليدي با سلول‌هاي بدون پلاسميد مقايسه شد. نتايج نشانگر اين هستند كه از محيط كشت انتخابي LB، M9 و 2X بيان پروتين مربوطه پس از گذشت 12 ساعت محيط كشت 2X بهترين عملكرد را از خود نشان داده و نتايج تست نين هيدرين بيانگر افزايش غلظت از 2/0 به 35/2 ميلي­گرم بر ميلي­ليتر است. در اين راستا نتايج به‌دست‌آمده با مطالعات قبلي مقايسه شد و پيشنهاد مي‌شود ساير ژن‌هاي مسير بيوسنتز نيز با همين روش بررسي شوند. همچنين مهندسي پروتئين هر يك از آنزيم‌هاي مسير و تغيير اجزاي محيط كشت مي‌تواند به افزايش فعاليت كمك كند.

Threonine is one of the essential amino acids in mammals, playing a pivotal role in biotechnology, particularly in pharmaceutical, food, and poultry nutrition. Nowadays, engineered strains of Escherichia coli are utilized in the industry to produce this important amino acid. The biosynthetic pathway of threonine from aspartate consists of five enzymatic steps, one of the key enzymes being aspartate semialdehyde dehydrogenase. In this study, specific primers for the asd gene were designed along with the restriction sites using bioinformatics tools and ordered, Subsequently, the enzyme gene was amplified via PCR and, after enzymatic digestion and ligation, introduced into the expression vector pET-21a. Thereafter, competent Escherichia coli cells were transformed with the recombinant plasmid. Finally, the threonine content in the minimal medium was measured using the ninhydrin method, and the produced threonine levels were compared with those of plasmid-free cells. The results indicate that among the selected LB, M9, and 2X media, the expression of the corresponding protein showed the best performance after 12 hours at 37°C in the 2X medium. Moreover, the results of the ninhydrin test indicate that the concentration of threonine has increased from 0.2 to 2.35 mg/ml. In this context, the obtained results were compared with previous studies, and it is suggested that other genes in the biosynthetic pathway be investigated using the same methodology. Furthermore, protein engineering of each enzyme in the pathway and modification of culture medium components could enhance activity.