مهندسي آنزيم اوريكاز آسپرژيلوس فلاووس در موقعيت279 با استفاده از جهش زايي هدفدار براي بهبود پايداري

Engineering of Aspergillus flavus uricase enzyme at position 279 using site-directed mutagenesis for improving thermostability

آنزيم اوريكاز يا اورات اكسيداز جزء دسته اكسيدازهاي بدون كوفاكتور مي باشد. آنزيم اوريكاز آسپرژيلوس فلاووس باعث كاتاليز اسيداوريك به 5-هيدروكسي ايزواورات وهيدروژن پراكسيد ميشود كه در نهايت اين تركيب طي واكنش غير آنزيمي به يك تركيب قابل دفع به نام آلانتوئين تبديل مي شود. اوريكاز يك آنزيم اصلي در تجزيه نوكلئوتيدهاي پوريني مي باشد. اين آنزيم توزيع گسترده اي درميان ميكروارگانيسم ها دارد اما انسان ها وتعدادي از نخستي هاي عالي به علت جهش هاي بي معني در دوره ميوسن اين آنزيم را از دست داده اند. هدف اين مطالعه جايگزيني اسيد آمينه آلانين در موقعيت279 به سيستئين جهت بررسي پايداري آنزيم اوريكاز مي باشد. براي بررسي اين موضوع از مطالعات بيوانفورماتيكي از قبيل سرورهايI-Mutant ، I-Stable استفاده كرديم. در اين تحقيق از پلاسميد pET28a(+)حاوي ژن اوريكاز وباكتريE.coli سويه BL21 مورد استفاده قرار گرفت. جهش زايي هدفدار به روش Quick-change PCR به منظور ايجاد جهش نقطه اي با استفاده از pfu DNA polymeras انجام شد و از كروماتوگرافي ميل تركيبي Ni-NTA براي تخليص پروتئين استفاده شد. پس از خالص سازي، دماي بهينه 25، 25 و همچنين pH بهينه 8، 9 به ترتيب براي آنزيم جهش يافته و وحشي به دست آمد. همچنين پايداري حرارتي آنزيم جهش يافته در دماهاي 40، 50 و 60 درجه سانتي گراد تقريبا 80 درصد فعاليت خود را از دست داده است. بنابراين به منظور پايدارسازي آنزيم هاي دارويي، از روش جهش زايي هدفدار مي توان استفاده كرد.

Uricase enzyme or urate oxidase is one of the oxidases without cofactors the uricase enzyme of Aspergillus flavus catalyzes uric acid into 5-hydroxyisoaurate and hydrogen peroxide, and finally this compound is converted into a removable compound called allantoin through a non-enzymatic reaction. Uricase is a main enzyme in the breakdown of purine nucleotides. This enzyme is widely distributed among microorganisms, but humans and higher primates have lost this enzyme due to nonsense mutations in the Miocene period. The aim of this study is to replace the amino acid alanine at position 279 with cysteine ​​to check the stability of uricase enzyme. To investigate this issue, we used bioinformatics studies such as I-mutant and I-stable serves. servers. In this research, plasmid pET28a(+) containing uricase gene and E.coli strain BL21 was used. Targeted mutagenesis was done by quick-change PCR method to create point mutation using pfu DNA polymerase. Ni-NTA affinity chromatography was used for protein purification. After purification, the optimal temperature of 25, 25 and also optimal PH of 8, 9 were obtained for the mutant and wild enzyme respectively. Also, the thermal stability of the mutant enzyme has lost almost 80% of its activity at temperatures of 40, 50, and 60 °C . Therefore, in order to stabilize medicinal enzymes, targeted mutagenesis can be used.