همسانه سازي و بيان ايمونوتوكسين اونتاك به صورت هيبريدي با دنباله اينتئيني

Cloning and Expression of Ontak Immunotoxin Using Intein Tag

مقدمه: اينتئين ها بخش هاي دروني در برخي پروتئين هاي مخمري و يوكاريوت هاي تك سلولي هستند كه مي توانند در فرآيند پيرايش پروتئين ها از مابقي پروتئين جدا شوند. بعد از شناسايي مكانيسم عملكرد اينتئين ها، كاربرد اين توالي ها در تخليص تك مرحله اي پروتئين هاي نوتركيب مورد توجه قرار گرفته و دنباله هاي خود برشگر اينتئيني مختلفي گسترش يافتند. مزيت روش كاربرد دنباله هاي اينتئيني براي تخليص پروتئين ها نسبت به بقيه روش هاي تخليص پروتئين، عدم احتياج به آنزيم هاي پروتئازي و مراحل حذف پروتئاز مي باشد كه اين روش را از لحاظ اقتصادي حائز اهميت مي كند. در اين مطالعه، ژن به رمز درآورنده Denileukin Diftitox (با نام تجاري اونتاك،Ontak ) بصورت مولكولي با دنباله اينتئيني تلفيق گرديد و ميزان بيان آن در پلاسميد pTXB1 مورد بررسي قرار گرفت. روش بررسي: در اين مطالعه، بر اساس جايگاه هاي چندتايي همسانه سازي (MCS) وكتور pTXB1، پرايمرهاي مناسب طراحي شدند و پس از تكثير قطعه كدكننده اونتاك، همسانه سازي با استفاده از آنزيم هاي NdeI و SapI انجام گرفت. اين سازه نوتركيب(PTX-IDZ) به سلول هاي E.coli سويه ER2566 ترانسفورم گرديد و بيان اونتاك مورد مطالعه قرار گرفت. نتايج: همسانه سازي توالي اونتاك در تلفيق با دنباله اينتئيني در وكتور بياني pTXB1 توسط PCR و برش آنزيمي تائيد شد. بيان پروتئين نوتركيب با روش SDS-PAGE آناليزو با روش لكه گذاري وسترن تائيد گرديد. نتيجه گيري: جايگاه آنزيم محدودكننده SapI در محل تلفيق توالي اونتاك با دنباله اينتئيني عدم ورود هيچ اسيد آمينه اضافه اي را در پروتئين هدف، تضمين مي نمايد. همچنين بيان ايمونوتوكسين اونتاك در اين سازه نسبت به بيان اين پروتئين به صورت تلفيق شده با دنباله هيستيديني ارزيابي گرديد. با توجه به بيان مناسب پروتيئن اونتاك، در مراحل بعدي، تخليص تك مرحله اي پروتئين دارويي اونتاك انجام خواهد گرفت.

Introduction: Inteins (INT) are internal parts of a number of proteins in yeast and some other unicellular eukaryotes, which can be separated from the immature protein during protein splicing process. After identifying the mechanism of intein action, applications of these sequences are be considered in the singlestep purification of recombinant proteins and different intein tags were developed. The most important advantage of using intein tags in purification of recombinant proteins than other affinity tags is no requirement of expensive protease enzymes and following additional steps to remove protease that make intein tags economically are considered more important. In the present study, denileukin diftitox immunotoxin (brand name Ontak), be fused with an intein tag and it was inserted in pTXB1 plasmid. Methods: In this study, with respect to multiple cloning sites (MCS) of pTXB1, specific primers were designed. Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed and encoding sequence of ONTAK was cloned using restriction sites of NdeI and SapI. Recombinant vector (PTX-IDZ) was transformed into E. coli strain ER2566 and expression of gene was studied. Results: The accuracy of recombinant construct was confirmed by PCR and enzymatic digestion. The produced recombinant proteins were confirmed by SDS-PAGE and Western blotting. Conclusion: Restriction site of SapI guarantees no additional residues incorporate in primary protein sequence. Also, the expression of this construct was analyzed in compare with fused protein to poly-His tag. According to the appropriate expression of fused protein in both constructs it was expected that one steppurification of considered drug protein will be success in the following steps.