جداسازي و شناسايي مايكوباكتريوم‌هاي سريع‌الرشد از آب و خاك در رباط‌كريم با استفاده از روش PCR- RFLP

Isolation and Identification of Rapidly Growing Mycobacteria from Water and Soil by PCR-RFLP Method in Robat Karim

زمينه و هدف: مايكوباكتريومهاي غيرتوبركلوزيس خصوصاً مايكوباكتريومهاي سريع الرشد پاتوژنهاي محيطي فرصت طلبي هستند كه نقش آنها در بيماريهاي انسان بهطور فزاينده شناخته شده است و انسانها ميتوانند از منابع مختلف محيطي خصوصاً آب و خاك دچار عفونت شوند. باتوجه به انتشار جهاني مايكوباكتريومهاي سريعالرشد، تشخيص و شناسايي آنها هم از نظر كلينيكي و هم از نظر مطالعات اپيدميولوژيك بسيار حائز اهميت است. در اين مطالعه فراواني مايكوباكتريومهاي سريعالرشد از منابع آب و خـاك در مـنـاطـق مـخــتلـف شـهـر ربـاط كـريم بـا اسـتـفاده از روش PCR-RFLP بـا مــورد هـدف قـرار دادن ژنـهـاي hsp65و 16S-23S Rrna مورد بررسي قرارگرفت. روش كار: در مطالعه حاضر 454 نمونه آب و خاك از مناطق مختلف شهر رباط كريم جمعآوري گرديد. بعد از استخراج DNA، قطعه hsp65 با استفاده از روش PCR-RFLPتكثير و سپس محصولات PCR با دو آنزيم محدودكننده BsteII و HaeIII هضم گرديد و قطعه 16S-23SRNA نيز تكثير و محصولات PCR با دو آنزيم محدودكنندهHaeIII, CfoI هضم گرديد و آناليز بر اساس الكتروفورز بر روي ژل پلي آكريل آميد انجام شد. يافته ها: بر اساس كشت و مشاهده ميكروسكوپي، 49 نمونه (5/21%) از 227 نمونه خاك و 144 نمونه (63%) از 227 نمونه آب از نظر مايكوباكتريوم مثبت گرديد و با استفاده از روش PCR-RFLP، 7 نمونه خاك و 29 نمونه آب داراي مايكوباكتريوم سريعالرشد بودند و نتايج حاصل از روش مولكولار با نتايج حاصل از كشت مطابقت كامل داشته و مايكوباكتريوم فـورتيتوم با فـراواني 8/27 %، مايكوباكتـريوم سريع الرشد عمده در مجموع نمونههاي آب و خاك بود. نتيجه گيري: مايكوباكتريوم فورتيتوم عمدهترين مايكوباكتريوم سريع الرشد جدا شده در مجموع نمونههاي آب و خاك در منطقه رباط كريم ميباشد.

Background & Objective: Nontuberculous mycobacteria (NTM) especially rapid growing mycobacteria (RGM) are opportunistic environmental pathogens and their role in human disease is increasingly recognized. In addition, several studies indicated that humans can be infected by NTM from various environmental sources especially soil and water. Identification of rapid growing mycobacteria is important for both clinical and epidemiological studies because of their worldwide propagation. Incidence of rapid growing mycobacteria from water and soil in different regions of Robat Karim was studied using PCR-RFLP method and targeting hsp65 gene and 16S-23SrRNA. Methods: In this study a total number of 454 water and soil samples were collected from different areas of Robat Karim. After decontamination of isolates by petroff method, the sediment obtained was cultured onto Lowenstein Jensen media and Ziehl Neelsen staining was performed for microscopic observations. After DNA extraction, hsp65 gene amplified by PCR-RFLP and then PCR products were digested by two restriction enzymes, BsteII and HaeIII, prior to undergoing polyacrilamid gel electrophoresis (PAGE). 16S-23S rRNA gene was also amplified and then PCR products were digested by restriction enzymes of HaeIII and CfoI and analyzed using PAGE. Results: Based on the culture and microscopic observations, 49 (21.5%) out of 227 soil samples and 144 (63%) out of 227 water samples were positive regarding mycobacterium. 7 soil samples and 29 water samples were contained rapid growing mycobacteria based on PCR-RFLP method. The results obtained by molecular method matched completely with those from culture method. Therefore, identification of Rapid Growing Mycobacterium has a sensitivity of 100% and mycobacterium fortuitum was the predominant isolated rapid growing mycobacteria in water and soil samples with a frequency of 27.8%. Conclusion: Mycobacterium fortuitum was the most dominant rapid growing mycobacterium isolated from soil and water samples in Robat Karim area.