بيان ژن cryIAb توسط پيشبر القا شونده با زخم ( MPI) به منظور افزايش مقاومت به آفت شب‌پره (Tuta absoluta) در گوجه فرنگي

Expression of cryIAb Driven by a Wound Inducible Promoter (MPI) in Tomato to Enhance Resistance to Tuta absoluta

آفت شب­پره گوجه­ فرنگي (Tuta absoluta) از جمله آفات مهم گوجه ­فرنگي در كشور ايران به شمار مي­رود. تغذيه اين آفت موجب خسارت %100-50 به ميوه گوجه ­فرنگي در جهان شده است. ژن cryIAb به بسياري از گياهان از جمله ذرت منتقل و موجب حفاظت آن­ها در مقابل حمله كرم ساقه­ خوار ذرت شده است. در اكثر مطالعات از پيشبرهاي دائمي مانند CaMV35S در فرآيند انتقال ژن به گياهان استفاده مي­شود كه اين امر به دليل مصرف دائمي انرژي گياه موجب تغيير در مسيرهاي متابوليسمي آن مي­گردد. پيشبر القا شونده با زخم (MPI (Maize Protease Inhibitor داراي قدرت و كارايي بالاتري از پيشبر CaMV35S است. بنابراين در پژوهش حاضر، براي اولين بار گياهان گوجه ­فرنگي تراريخت (رقم فلات) حاوي ژن cryIAb تحت پيشبر MPI توليد شد. پيشبرMPI از گياه ذرت جدا و در ناقل بياني pPZP122 جايگزين پيشبرCaMV35s گرديد. پس از جداسازي ژنcryIAb از ناقل pCIB4421، سازه pPZP122:MPI:CryIAb ساخته شد و به سويه AGL1 آگروباكتريوم منتقل شد. تراريخته نمودن گوجه ­فرنگي بصورت In planta انجام و گزينش اوليه گياهان ترايخت در محيط كشت­هاي حاوي جنتامايسين انجام شد. حضور ژن cryIAb در گياهچه­ هاي مقاوم نسل اول و دوم به ترتيب %62/5 و % 75/58 با PCR مورد تاييد قرار گرفت. حضور پروتئين در لاين­ هاي تراريخت نسل دوم با استفاده از روش لكه­ گذاري نقطه­ اي پروتئين و به كمك پادتن اختصاصي چند دودماني پروتئين CryIAb، مورد تاييد قرار گرفت. نتايج زيست سنجي گياهان تراريخته نسل دوم با استفاده از آفت توتا، مقاومت بهبود يافته گياهان تراريخته عليه آفت را نشان دادند. بنابراين پيشبر القا شونده با زخم MPI مي­تواند براي ساخت سازه ­هاي حاوي ژن­هاي كد كننده پروتئين حشره ­كش (مانند انواع مختلف cry) و تراريختي ساير گياهان مفيد باشد تا ژن مورد نظر صرفا در زمان حمله آفت بيان شود.

Tomato leafminer (Tuta absoluta) is one of the important pests of tomato in Iran. It causes serve losses to tomato yield between 50 to 100% in the world. The cryIAb gene has been introduced into many plant species, including maize resulting in protection of the maize plants against corn borer larvae. In most studies, constitutive promoters such as CaMV35S were employed for genetic transformation; however the constitutive expression of genes led to changes in plant metabolic pathways due to permanent energy consumption in plants. Since, wound inducible promoter MPI (Maize Protease Inhibitor) posses more efficiency and strength than CaMV35S promoter. Therefore, in the current study, transgenic tomato (cv. Falat) plants harboring cryIAb gene under control of the MPI promoter were developed for the first time. The MPI promoter was isolated from maize and cloned into pPZP122 expression vector replacing the CaMV35S promoter. The cryIAb gene was isolated from pCIB4427 and cloned in pPZP122:MPI:cryIAb and the resulting construct was transformed into Agrobacterium AGL1 strain using In planta approach. Initial selection of the transgenic plants was carried out in media culture containing gentamicin. PCR analysis confirmed the presence of transgene in gentamycin-resistance plants in the first and second generations by rate of 62.5% and 75.58%, respectively. Protein dot blotting using anti-CryIAb polyclonal antibody confirmed the presence of protein in the second generation of transgenic lines. Based on the result of Tuta bioassay, transgenic plants demonstrated an enhanced resistance against Tuta. Thus, the wound inducible promoter MPI can be used in genetic transformation of crop plants if insecticidal protein-encoding genes (such as different types of cry) are used and therefore, it is important to be used when plants asked to express only when are being attacked by insect pests.