شناسايي و تحليل بيوانفورماتيكي ژن هاي ضد ميكروبي ديفنسين از شش ژنوتيپ گياه عدس

Identification and molecular cloning of defensin antimicrobial genes from six lentil genotypes

ديفنسين هاي گياهي، خانواده اي بزرگ از پپتيدهاي ضد ميكروبي غني از سيستئين هستند. اين پپتيدها، مولكول هايي با جرم مولكولي 5 تا 7 كيلودالتون و داراي هشت اسيد آمينه سيستئين محافظت شده هستند كه در ايجاد پيوندهاي دي سولفيدي نقش دارند. در اين پژوهش برخي اعضاء خانواده ژني ديفنسين در ژنوتيپ هاي مختلف گياه عدس جداسازي و بررسي شدند. ابتدا، تمام توالي هاي كدكننده ي ژن هاي ديفنسين گياهان دو لپه اي از بانك ژن دريافت شد. توالي هاي كد كننده ي دريافت شده، در كتابخانه EST گياه عدس همرديف و نتايج حاصل با هم مخلوط و سر هم بندي شدند. كانتيگ ها و سينگلتون هاي حاصل از سرهم بندي با استفاده از ابزار BLASTn، عليه پايگاه داده nr همرديف شدند. از كانتيگ ها و سينگلتون هاي داراي چارچوب خوانش باز كامل ديفنسين براي طراحي آغازگرها استفاده شد. در مرحله ي بعدي، از ژنوتيپ هاي گچساران، محلي، Filip2003-2L، Filip2003-9L، Filip2005-2L و Filip2006-10L گياه عدس استخراج DNA صورت گرفت. در نهايت، توالي ژنومي ديفنسين ها با استفاده از واكنش PCR تكثير شد و پس از همسانه سازي در ناقل pTZ57R/T مورد توالي يابي قرار گرفت. نتايج، شباهت كامل را در ديفنسين هاي جداسازي شده از ژنوتيپ هاي مورد بررسي نشان داد. ژن هاي شناسايي شده همچنين داراي اينترون هايي با طول متغير بودند كه ساختاري محافظت شده داشتند و حاوي عناصر تنظيمي براي پاسخ به عوامل و شرايط مختلف بودند. در اين پژوهش براي اولين بار، توالي ژنومي سه ژن از ژن هاي خانواده ديفنسين از ژنوتيپ هاي مختلف گياه عدس جداسازي و ساختار و ويژگي هاي آن ها مشخص شد.

Plant defensins are a large family of cysteine-rich antimicrobial peptides. These peptides are small molecules with molecular mass between 5 and 7kD and eight conserved cysteines that are involved in disulfide bond formation. In the present study, some members of defensin gene family were isolated and characterized from lentil genotypes. All coding sequences of the defensin genes of dicotyledon plants were retrieved from GenBank. The retrieved coding sequences were aligned against lentil EST library and the resulted sequences were pooled and assembled. The resulted contigs and singletons were aligned against GenBank nr database using BLASTn tool. The contigs and singletons with the full open reading frame were used to primer design. In the next step, DNA extraction was performed from Gachsaran, Mahali, Filip2003-2L, Filip2003-9L, Filip2005-2L and Filip2006-10L genotypes. Finally, by using PCR, genomic sequence of defensins were amplified, cloned into pTZ57R/T plasmid and sequenced. The results showed complete identity among the isolated defensins from all genotypes. The identified genes also contain conserved introns with variable length that comprised of regulatory elements for response to different factors and conditions. For first time in this study, genomic sequences of three members of defensin gene family were isolated from lentil genotypes and structures and features of them were determined.