طراحي بيوانفورماتيكي و ساخت كاست ژني دربردارنده‌ي ژن‌هاي blf1، ctxB و stxB

J Neyshabur Univ Med Sci 2020, 8(4): 73-87 Back to browse issues page Bioinformatic Design and Construction of a Chimeric Gene Comprising the stxB, ctxB and blf1 Genes

باكتري بورخولدريا سودومالئي، ويبريوكلرا و شيگلا ديسانتري عامل بيماري ميلوئيدوزيس، وبا و شيگلوز در انسان مي­ باشند. پروتئين­ هاي BLF1 مربوط به B. pseudomallei، ­CTxB ويبريوكلرا و StxB شيگلا ديسانتري خاصيت آنتي­ژنيك، ادجوانتي مخاطي، حاملي و ايمني‌زايي دارند. هدف اين مطالعه، ساخت كاست ژني دربردارنده­ ي ژن­ هاي blf1، ctxB وstxB و بيان­ پروتئين آن­ها در E. coli مي­­­ باشد. مواد و روش­ها با استفاده از نرم ­افزار­هاي بيوانفورماتيك Protparam و Modeller، حالت­ هاي مختلف پروتئين كايمريك ژن­هاي مربوطه بررسي شد. ساختار دوم پروتئين و اپي­ توپ­ هاي خطي و ساختاري نيز تعيين گرديد. ژن‌هاي blf1 و stxB از پلاسميد pET28a-BLF1-STxB، PCR و قطعه 850 جفت بازي BLF1-STxB با جايگاه­ه اي آنزيمي NotI وSalI در وكتور بياني pET28a-CTxB زيرهمسانه­سازي و به باكتري E. coli سويه­ي BL21(DE3) ترانسفورم شد. پس از توالي‌يابي، بهينه‌سازي بيان ژن سنتزي تحت القايIPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside) و درجه حرارت 25 درجه سانتيگراد انجام و بوسيله تكنيك SDS-PAGE مورد ارزيابي قرار گرفت. يافته­ ها شاخص ناپايداري پروتئين كايمر برابر با 06/40 و نيمه ­عمر آن در E. coli بيش از 10 ساعت به دست آمد. شاخص سازگاري كدون سازه­ ي كايمر به 9/0 و محتواي GC آن به 9/54 درصد افزايش يافت. بهترين ترتيب ممكن براي ساخت واكسن نوتركيب، ممزوج سه­تايي CTxB-BLF1-STxB بدست آمد. بيان پروتئين نوتركيب از ژن سنتزي تحت القاي IPTG، منجر به توليد پروتئيني با وزن مولكولي 48 كيلودالتون شد. نتيجه­ گيري با توجه به توانايي توقف پروتئين­ سازي BLF1، خاصيت حاملي STxB و خاصيت ادجوانتي CTxB، قرار دادن اين سه ژن در يك كاست ژني به بهترين حالت، مي­تواند به عنوان يك كانديد واكسن مناسب مورد توجه قرار گيرد.

Introduction bacteria species; Burkholderia pseudomallei, Vibrio cholera, and Shigella dysenteriae are the main pathogen causing Melioidosis, Cholera, and Shigella in humans respectively. bacterial species have a protein that has antigenic prosperities along with being a mucus based adjuvant thus easing their delivery and immunogenicity. These proteins were BLF1(B. pseudomallei), CTxB (V. cholera), and StxB (S. dysenteriae). The goal of this study was a chimeric gene composed of Blf1, CTxB, and StxB and expression of these proteins from E.coli. Materials and Methods Using Bioinfoamtic tools such as Protparam and Modeller the different combinations of the chimeric protein were assessed. The blf1 and stxB genes were PCR amplified from pET28a-BFL1-StxB. The 850bp fragment encompassing BFL1-StxB was cloned using SalI and NotI in the pET28a-CTxB vector. The engineered plasmid was transformed in BL21(DE3). The ctxB-stxB-blf1 gene was expressed following induction with IPTG. This induction was then assessed using SDS-PAGE. Results Chimeric protein instability index gets 40.06 and the half-life of it in E. coli was over 10 hours. Codon Adaptive Index (CAI) rise to 0/9 and GC content increase to 54.9. The optimal vaccine combination for the chimeric protein was determined to be CTxB-BLF1-StxB. Expression of recombinant protein in E. coli led to the production of a chimeric protein with 48 kDa molecular weight. Conclusion The findings of the current study revealed that this antigen can be raised as a recombinant vaccine candidate which can be due to such factors as a property of the ability to stop protein synthesis in BLF1, CTxB adjuvant, and delivery of StxB protein.