تشخيص و تفسير آسان، كم هزينه و دقيق ويروس نيوكاسل و تفريق سويه حاد از غيرحاد با روش RT-ARMS PCR آشيانه اي

Easy, low cost, and precise Identification and interpretation of Newcastle virus and differentiation of its velogenic from lentogenic strains by using the nested RT-ARMS PCR

بيماري نيوكاسل، يك بيماري ويروسي ماكيان است كه توسط پاراميكسوويروس تيپ 1 از جنس Avulavirus است ايجاد مي­شود و تشخيص سريع و دقيق آن از اهميت بالايي برخوردار است. حدت اين ويروس به پروتئين اتصالي (F)، يكي از شش پروتئين اين ويروس، بستگي دارد كه مي­تواند ابراي تشخيص حدت سويه­هاي آن استفاده شود. بنابراين، اين مطالعه بنا دارد با توجه به پيشرفت­هاي علم بيوانفورماتيك، روشي پيشنهاد نمايد كه براي شناسايي ارزان و آسان ويروس نيوكاسل و تفريق سويه­هاي حاد و غيرحاد آن مورد استفاده قرار گيرد. ابتدا توالي كليه­ي سويه­هاي در دسترس ويروس نيوكاسل از بانك اطلاعاتي NCBI به روش همترازي (BLAST) جمع­آوري و پس از همرديف­سازي، پرايمرهاي عمومي و اختصاصي سويه­ها طراحي شدند. در مرحله­ي بعد تأييد ويروس نيوكاسل با روش PCR و پرايمرهاي عمومي روي cDNA نمونه­ي كنترل مثبت بهينه­سازي شد. سپس تفريق سويه­ي غيرحاد از حاد با روش ARMS-PCR (سيستم بازتاب تكثيري جهش) با دو پرايمر فوروارد اختصاصي بهينه­سازي شد. از آن جايي كه روش مورد استفاده در اين مطالعه نوعي ARMS-PCR است كه بر روي cDNA حاصل از واكنش RT انجام گرفته است و همچنين به علت آن كه به منظور افزايش ويژگي از محصول PCR اول به عنوان الگو براي واكنش PCR آشيانه­اي استفاده شده است "RT-ARMS-PCR آشيانه­اي" نام­گذاري شده است. سپس تعدادي از نمونه­هاي جمع­آوري شده از مزارع پروش مرغ گوشتي با اين روش و همچنين Real-Time PCR به عنوان تست استاندارد طلايي آزمايش شدند. نتايج نشان داد كه حساسيت و ويژگي تشخيص ويروس و سويه­ي آن در هردو روش با هم مطابقت كامل داشتند. در مجموع اين روش در مقايسه با روش Real-Time PCR با صرف زماني اندكي بيش­تر ولي هزينه، تجهيزات و پيچيدگي بسيار كم­تر به عنوان جايگزين مناسبي براي روش Real-Time PCR براي تشخيص ويروس نيوكاسل و تفريق سويه­هاي حاد از غيرحاد پيشنهاد مي­گردد. كليدواژه‌ها

Newcastle disease is a viral disease of poultry that is caused by type 1 paramyxovirus, from the Avulavirus genus and its fast and precise diagnosis is of high importance. Virulence of this virus depends on Fusion protein (F), one of six proteins of this virus, which can be used for detection of the virus virulence. So, this study aims to design new primers according to bioinformatics science progression and suggest a cheaper and easier method for the identification of Newcastle virus (NDV) as well as distinguish lentogenic from velogenic strains with higher sensitivity and specificity. First, all available strains of Newcastle viruses were collected from NCBI data bank using Blast tool and after multiple alignments, universal and specific primers were designed. In the next step, identification of NDV was set up using universal primers by PCR on cDNA of the control positive sample. Then differentiation of lentogenic from velogenic strains set up by ARMS (Amplification Refractory mutation system)-PCR (Polymerase chain reaction) using specific primers. Because the method was performed on cDNA obtained from reverse transcription reaction (RT), and because the PCR product of the first PCR reaction was used as a template for nested second PCR reaction it is called “nested RT-ARMS PCR”. Afterward, some samples from broiler farms were tested by this method and then compared by Real-Time PCR as a golden standard test. The results showed that sensitivity and specificity of identification of the virus and its strains were fully compatible in both methods. To sum up, this method which consumes a little bit more time but lower expenses, equipment and complexity in comparison with Real-Time PCR, can be suggested as a suitable substitution for the detection of NDV and distinguishing its velogenic from lentogenic strains.