رابطه بين غلظت كلسيم داخل سلولي و توليد راديكال‌هاي آزاد اكسيژن در اسپرماتوزواي تازه و منجمدـ ذوب شده انسان

The Relation between Intracellular Calcium Concentration and Reactive Oxygen Species Production in Fresh and Cryopreserved-Thawed Human Spermatozoa

نگهداري اسپرم‌ها به صورت منجمد در نيتروژن مايع يك روش پركاربرد براي حفظ طولاني مدت آن‌ها است. بسياري از اين اسپرم‌ها پس از ذوب شدن، آسيب ديده و زنده نمي‌مانند و بسياري نيز قدرت تحرك خود را از دست مي‌دهند. اين آسيب‌ها ناشي از آسيب به غشا اسپرم و تغيير نفوذپذيري به يون‌ها به خاطر تغييرات فشار اسمزي، تشكيل كريستال‌هاي يخ و افزايش توليد راديكال‌هاي آزاد اكسيژن است. هدف از اين مطالعه تعيين رابطه بين غلظت كلسيم داخل سلولي و توليد راديكال‌هاي آزاد اكسيژن در اسپرماتوزواي تازه و منجمدـ ذوب شده انسان بود. روش بررسي: در اين مطالعه نيمه تجربي كه در سال 1392 انجام شد، تعداد 35 نمونه سيمن انسان بارور به طور تصادفي انتخاب و به دو گروه تازه و منجمدـ ذوب شده تقسيم شدند. اسپرم‌هاي گروه دوم به روش‌هاي استاندارد انجماد براي يك ماه در نيتروژن مايع نگهداري شدند. اسپرم‌هاي تازه و اسپرم‌هاي منجمد، پس از ذوب شدن در معرض 10 ميكرومولار اينوفور كلسيم (A23187) قرار گرفتند. ميزان تحرك، بقا و وضعيت آكروزوم در هر دو گروه در شروع آزمايش و بعد از قرار گرفتن در معرض اينوفور كلسيم بررسي شد. محتواي كلسيم داخل سلول، با روش فلوسيتومتري و استفاده از رنگ فلوروسنت Flou-3/AM و ميزان توليد راديكال‌هاي آزاد اكسيژن با استفاده از لومينول و با روش كمي ‌لومينيسنس ارزيابي شد. داده‌هاي جمع‌آوري شده با آزمون‌هاي من‌ـ ويتني و پيرسون تجزيه و تحليل شدند. يافته‌ها: درصد كل اسپرم‌هاي زنده، متحرك و پيشرونده و درصد اسپرم‌هاي با آكروزوم سالم پس از پروسه انجمادـ ذوب به طور معني‌داري كاهش يافت. افزودن A23187 به محيط سبب افزايش كلسيم داخل سلولي اسپرم‌هاي زنده شد، اما درصد اسپرم‌هاي زنده و متحرك هر دو گروه را كم كرد. توليد راديكال‌هاي آزاد اكسيژن را به ازاي سلول‌هاي زنده در هر دو گروه بيشتر كرد، ولي اين افزايش در گروه منجمدـ ذوب شده به طور معني‌داري از گروه تازه بيشتر بود(001/0p<). نتايج وجود يك رابطه مثبت معني‌دار بين كلسيم داخل سلولي و توليد راديكال‌هاي آزاد اكسيژن را نشان داد. نتيجه‌گيري: يون كلسيم براي عملكرد طبيعي اسپرم لازم است، اما افزايش ورود كلسيم به وسيله A23187 به اسپرم‌هاي تازه يا منجمد ـ ذوب شده، سبب آسيب بيشتر و كاهش حركت و بقا مي‌شود. ميزان راديكال‌هاي آزاد اكسيژن رابطه مستقيم و معني‌داري با كلسيم داخل سلولي دارد. آسيب‌هاي ناشي از انجماد با مقادير زيادتر كلسيم داخل سلولي تشديد مي‌شوند و اين مسئله ممكن است به خاطر افزايش توليد راديكال‌هاي آزاد اكسيژن باشد.

In this quasi-experimental study conducted in 2013, 35 samples of fertile human cement were randomly selected and divided into two groups: fresh and frozen-thawed. The sperm of the frozen-thawed group were preserved under liquid nitrogen for one month. The effect of 10 µM calcium ionophore A23187 was evaluated on fresh and thawed sperm motility, viability, and acrosome reaction. Oxygen free radical production and intracellular calcium content were evaluated using luminol and Flou-3/AM staining by chemiluminescence and flowcytometric method, respectively. Data were compared using the Mann–Whitney test. P<0.05 was considered statistically significant. Results: The percentage of alive, motile and progressive sperm and the percentage of sperm with intact acrosome decreased significantly after the freezing-thawing process. The addition of A23187 to the medium increased intracellular calcium in live sperm but decreased the percentage of live and motile sperm in both groups. The production of free radicals increased per live cell in both groups, but this increase was significantly higher in the frozen-thawed group than in the fresh group. The results indicated a significant positive relationship between intracellular calcium and the production of oxygen free radicals. Conclusion: Calcium ions were required for normal sperm function, but increased calcium entry by A23187 into fresh or frozen-thawed sperm causes more damage and reduced motility and survival. The amount of oxygen free radicals had a direct and significant relationship with intracellular calcium. Freezing damage was exacerbated by higher levels of intracellular calcium, which may be due to increased production of oxygen free radicals.