ارتقاي عملكرد و افزايش تكثير سلول‌هاي بنيادي اسپرماتوگوني با ماتريكس نانوفيبر پلي‌آميدي

Polyamide Nanofibers Matrix Promotes Proliferation and Function of Mouse Spermatogonia Stem Cells

هدف از مطالعه حاضر ارزيابي اثر ماتريكس برون‌سلولي نانو رشته‌اي پلي‌آميد بر تكثير و عملكرد سلول‌هاي بنيادي اسپرماتوگوني (SSCs) بچه موش 6 رو در محيط In Vitro بوده است. سلول‌هاي بنيادي اسپرماتوگوني، از بيضه موش 6 روزه جدا شده و در خانه‌هاي يك ظرف كشت 6 خانه‌اي (3 خانه آن توسط ورقه نانوفيبر پوشانده بوده) به طور جداگانه در حضور فاكتورهاي رشد GDNF bFGF و EGF با سه بار تكرار كشت داده شدند. تعداد كلني‌هاي SSCs، مساحت كلني‌ها و تعداد سلول به ازاي هر كلني در روزهاي هفتم و دهم در هر گروه اندازه‌گيري شد. از رنگ‌آميزي ايمونوفلورسنت جهت بررسي كيفي بيان نشانگرهاي پروتئيني ?6-Integrin, Thy-1, ?1-Integrin, oct-4, PLZF و C-kit در روز دهم در هر دو گروه استفاده شد. بيان ژن‌هاي مربوط به سلول‌هاي زاينده با استفاده از تست RT-PCR در روز دهم پس از كشت در دو گروه مقايسه شد. جهت بررسي عملكرد سلول‌ها در هر دو گروه سلول‌هاي كلني‌هاي حاصله به موش بالغ نابارور شده پيوند زده شد. .براي آناليز داده‌ها كمي از نرم‌افزار SAS و از مدل خطي عمومي استفاده شد و ميانگين‌ها به كمك آزمون چند دامنه‌اي دانكن مقايسه شدند.در آزمايش فاكتوريل انجام شده تعداد كلني‌هاي كشت شده بر روي ورقه نانوفيبر به طور معني‌داري (05/0) نسبت به كلني‌هاي كشت شده در ظرف بدون نانوفيبر بيشتر بود. همچنين تعداد سلول‌ها در هر كلني و مساحت كلني‌ها در گروه بدون نانوفيبر كاهش معني‌داري (05/0) نسبت به گروه با نانو فيبرداشت. رنگ‌آميزي ايمونوفلورسنت نشان داد كه كلني‌ها متشكل از SSCs بودند. زيرا رنگ¬آميزي براي نشانگرهاي ?6-Integrin, ?1-Integrin, Thy-1, oct-4, PLZF مثبت و براي نشانگر C-kit به طور نسبي منفي بودند. بر اساس نتايج RT-PCR ميزان بيان ژن‌هاي GFR?-1, Stra8, Vasa, ?6, ?1, thy-1, Oct-4 در گروه كشت با استفاده از نانوفيبر نسبت به گروه كشت بدون نانوفيبر بيشتر و ژن C-kit در گروه كشت بدون نانو به طور نسبي بيشتر بوده است. در عين حال ژن Nanog به عنوان يك ژن پرتواني در هر دو گروه بيان نشده است. نتايج نشان داد كه استفاده از ماتريكس برون‌سلولي نانو رشته‌اي در كشت سلول‌هاي اسپرماتوگوني بچه موش 6 روزه در خالص‌سازي و بهبود كمي و كيفي وهمچنين بر عملكرد سلول‌هاي SSCs اثر فزاينده دارد.

The fate of mouse spermatogonia stem cellsʹ (SSCs) regulation is controlled by the interplay of signaling networks that either promote self- renewal or induce differentiation. It has been proven that cytokines, growth factors and feeder layers are capable of inducing self- renewal or reducing apoptosis in SSCs, suggesting that the self- renewal signaling pathways and maintenance of cells are promoted by other such triggers as the chemical or physical properties of the Extracellular Matrix (ECM). To investigate the issues, a synthetic polyamide matrix (ultra-web) whose nanofibrillar organization resembles the ECM/basement membrane was employed. Testis cells harvested from the NMRI mouse were cultured on either a nanofiber or a non-nanofiber surface for 10 days. GDNF, bFGF and EGF were taken into account as growth factors. Several tests were conducted on the7th and 10th days past of the culture. Colony assay revealed a higher colony number as well as higher cell number/colony on the nanofiber surface on day 10. Such SSCs markers as a6, c-kit, pi, thy-1, OCT-4 and Plzf were also detected using immunoflourecent staining. Reverse Transcription-PCR test revealed the expression of such genes as GFRa-l,Stra8, Vasa, a6, pi, thy-1 and OCT-4 for SSCs on the nanofiber and the non-nanofiber surfaces. For functional evaluation, the single cellsʹ suspension from SSCs colony were microinjected into seminiferous tubules of infertile recipients. Donor germ cells from both groups (nanofiber and non- nanofiber surfaces) were present in the recipient testis. Results indicated that the growth of SSCs on this nanofibrillar surface greatly enhanced proliferation, self- renewal and maintenance in comparison with growth on the non-nanofiber culture surface, despite the presence of growth factors in either of the systems. Thereby it being concluded that a nanofiber surface can provide a suitable microenvironment for SSCs in an in vitro culture system. Keywords: Nanofiber matrix, Spermatogonia! stem cells, Extracellular matrix (ECM).