همسانه سازي ژن ddh از Corynebacterium glutamicum در راستاي افزايش توليد اسيدآمينه ليزين

سابقه و هدف: L– ليزين يكي از اسيدهاي آمينه ضروري است كه به دليل كاربرد بسيار در صنايع مختلف، در سال هاي اخير تقاضا براي اين اسيد آمينه افزايش يافته و اين منجر به گسترش تحقيقات براي توليد صنعتي اين اسيدآمينه شده است. روش بررسي: در اين پژوهش با بهينه سازي ژنتيكي سعي در افزايش بازده توليد اين اسيدآمينه شد. پس از بررسي آنزيم هاي تاثيرگذار در مسير بيوسنتز ليزين، ژن ddh كدكننده آنزيم دي آمينوپيملات دهيدروژناز انتخاب شد. پس از استخراج DNA كروموزومي سويه Corynebacterium glutamicum ATCC 21799 و طراحي پرايمر، قطعه ژني جدا شده و به منظور تسهيل همسانه-سازي و تعيين ترادف نوكليوتيدي در وكتور TAcloning كلون گرديد. هضم آنزيمي دو وكتور TAcloning و pET28a توسط آنزيم-هاي برشي SalI و EcoRI انجام و پس از تيمار وكتور با آلكالين فسفاتاز، واكنش ليگاسيون صورت گرفت. سپس در سوش E.coliDH5? و در نهايت در ميزبان بياني E.coliBL21(DE3) ترانسفورم شد. يافته ها: مشاهده باند bp1150 در نمونه هاي PCR و محصول پلاسميد تخليص شده و هضم شده با دو آنزيم مذكور و همچنين نتيجه تعيين توالي نشان داد كه ژن مورد نظر به درستي كلون گرديده است. بررسي ميزان بيان پروتيين نوتركيب توسط ژل SDS-Page تاييدي ديگر بر صحت كلون سازي و فعاليت پروموتور مي باشد. نتيجه گيري: در اين تحقيق براي اولين بار ميزان بيان آنزيم دي آمينوپيملات دهيدروژناز در اين وكتور بياني افزايش قابل قبولي را نشان داد.

Background: Due to wide range of application of L-Lysine, as an essential amino acid, in different industries, the demand for this amino acid has been increased and this has been led to the development of research on industrial production of L-Lysine. Materials and methods: In this study, we tried to increase the yield of production of L-Lysine by genetic optimization. After inspection of different effective enzymes in Lysine biosynthesis pathway, Diaminopimelate dehydrogenase (EC1.4.1.16) enzyme was selected. This enzyme would be coded by ddh gene. After chromosomal DNA extraction of C.glutamicum ATCC 21799 and designing of primers, the gene fragment was separated from genome by PCR with pfu DNA polymerase enzyme and was cloned in TAcloning vector for facilitation of cloning and determination of nucleotide sequence. Then, enzymatic digestion of TAcloning vector and pET28a vector were performed by EcoRI and SalI restriction enzymes which their products were ddh gene and linear vector. Ligation reaction was accomplished and for checking the accuracy of ligation, it was transformed into E.coliDH5? and finally in expression host, E.coli BL21(DE3). Results: The 1150bp band in PCR products and enzymatic digestion of extracted vectors with EcoRI and SalI, sequencing and SDS-PAGE confirmed the accuracy of cloning. Recombinant bacterial colonies were investigated and confirmed by two methods (PCR and enzymatic digestion). Conclusion: This study showed significant increased expression rate of DAP dehydrogenase enzyme in this expression vector for the first time.