بقاي رو رستي Pseudomonas viridiflava و جدايه‌هاي مشابه عامل يا همراه بلاست مركبات روي علف‌هاي هرز غالب باغ‌هاي مركبات مازندران

EPIPHYTIC SURVIVAL OF Pseudomonas viridiflava AND RELATED STRAINS,THE INCITANTS OF OR ASSOCIATED WITH THE CITRUS BLAST DISEASE ON PREDOMINANT WEEDS IN CITRUS GROVES IN MAZANDARAN

بيماري بلاست يكي از بيماري‌هاي مهم مركبات در شمال ايران محسوب مي‌شود (SHAMSBAKHSH and RAHIMIAN 1997). خسارت عامل بيماري اغلب در فصول سرد سال در مركبات ديده مي‌شود ولي در ماه‌هاي گرم سال روي ساير گياهان از جمله علف‌هاي هرز بقاي اپي فيتي دارد. طي سال‌هاي 1388 و 1389 از علف‌هاي هرز باغات مركبات شهرستان‌هاي بابلسر و ساري شامل آكاليفا (Acalypha sp.) ، چمن يكساله (Poa annua) ، علف قناري(Phalaris canariensis) ، قياق (Sorghum halepense) ، مرغ (Cynodon dactylon) ، چسبك (Setaria viridis) ، دانه تسبيحي (Aegilops ovata) ، چچم (Lolium sp.) و تاج خروس (Amaranthus retroflexus) نمونه‌برداري شد. يك باكتري ميله‌اي شكل گرم منفي، هوازي و داراي چند تاژك قطبي از تمامي اين گونه‌ها جدا گرديد. كلني‌هاي باكتري روي محيط آگار غذايي حاوي سوكروز تقريباً مدور برجسته و سفيد تا كرم رنگ بود. جدايه‌ها قادر به توليد رنگ فلورسنت روي محيط King-B بودند ولي در توليد لوان و لهانيدن برش‌هاي سيب زميني متغير بودند. جدايه‌ها اكسيداز و آرجي نين دي هيدرولاز منفي، ولي كاتالاز و اوره آز مثبت بودند. همه جدايه‌ها ژلاتين، كازيين، آرژنين و تويين 80 را هيدروليز كرده ولي نشاسته و اسكولين را هيدروليز نكرده و تيروزيناز منفي بودند. بالاترين غلظت قابل تحمل كلريد سديم در جدايه‌ها 5 درصد بود. جدايه‌ها قادر به استفاده از D-فروكتوز، D-گلوكز، D-زايلوز، مانيتول، رافينوز، گليسرول، L- آلانين، L- لوسين،L-آسپاژين، L-تريپتوفان، فومارات، پيروات، L- تارتارات،D - تارتارات، سيترات و مالات بوده ولي توانايي استفاده از آرابينوز، دولسيتول، اتانول، پروپانول، L- تايروزين، L- متيونين، و اگزالات را به عنوان منبع كربن نداشتند. هم‌چنين در استفاده از سوكروز، اسكولين و پكتات متغير بودند. واكنش فوق حساسيت بعد از تزريق سوسپانسيون باكتري به برگ‌هاي شمعداني بعد از 24 ساعت و بيماري‌زايي روي برگ‌هاي مركبات بعد از 5 تا 7 روز به اثبات رسيد . بر اساس نقوش الكتروفورزي پروتيين‌هاي سلولي جدايه‌ها به چهار گروه تقسيم شدند: گروه اول شامل جدايه‌هاي چمن يك ساله، چچم، فالاريس، قياق و چسبك كه بينابين جدايه‌هاي استاندارد Pseudomonas viridflava (Pv) و(Pss) P. syringae pv. syringae بودند، گروه دوم شامل جدايه آكاليفا بود كه شباهتي با هيچ يك از جدايه‌هاي استاندارد Pv و Pss نداشت، در گروه سوم جدايه به دست آمده از تاج خروس به جدايه Pss و جدايه‌هاي به دست آمده از دانه تسبيحي و مرغ در گروه چهارم قرار گرفته و Pv تشخيص داده شدند. در آزمون PCR نمايندگان جدايه‌ها با دو آغازگر rpoD و gyrB به ترتيب دو قطعه 850 و 1200 bp را تكثير نمودند. توالي‌هاي نوكليوتيدي به دست آمده، پس از همرديف‌سازي چندگانه (Multiple sequence alignment) با برنامه Clustal W با ساير توالي‌هاي مربوط به اين ناحيه در گونه‌هاي مختلف Pseudomonas موجود در بانك ژن (NCBI) مقايسه شدند. با توجه به خصوصيات فنوتيپي و ژنوتيپي، جدايه‌ها متعلق به جنس Pseudomonas و جدايه‌هاي دانه تسبيحي و مرغ به گونه Pv. و جدايه تاج خروس به گونهPss. تعلق دارند. ويژگي‌هاي به دست آمده از چمن يكساله، چچم، فالاريس، قياق و چسبك بينابين .Pv و Pss. بود. اين اولين گزارش از بقاي اپي فيتيPv روي علف‌هاي هرز در ايران است.

Citrus blast is one of the important diseases of citrus in north of Iran. The disease causes considerable damage during and immediately after the cold seasons. The causal agents have epiphytic survival on diverse weeds during spring and summer. During 2009-2010, samples were collected from several candidate weed plants including: Poa annua, Phalaris canariensis, Sorghum halepense, Cynodon dactylon, Setaria viridis, Acalypha sp., Aegilops ovate, Lolium sp. and Amaranthus retroflexus. A rod- shaped, gram negative, aerobic, fluorescent bacterium was isolated from all samples. The bacterium possessed several polar flagella. Strains were negative in oxidase and arginine dihydrolase but positive in catalase and urease tests and tolerated 5% NaCl. They were variable in production of levan from sucrose and rotting potato tuber slices. All strains hydrolyzed gelatin,casein and Tween 80. Nitrate was not reduced to nitrite, and production of reducing substances from sucrose was variable. All strains produced a hypersensitive reaction in geranium (Pelargonium X hortorum Baily). Glucose, fructose, xylose, mannitol, raffinose, glycerol, alanin, leucin, asparagine, tryptophane, fumarate, pyruvate, D- and L- tartrate,citrate and malate were utilized as carbon sources by all strains; none could utilize arabinose, dulcitol, ethanol, propanol, tyrosine, methionine, and oxalate. They were variable in utilization of sucrose, esculin and pectate. Pathogenicity of most of strains on citrus was confirmed 5-7 days after inoculation.Based on The protein profile strains were devided into four groups . The first group consisting of isolates from Poa annua, Phalaris canariensis, Sorghum halepense, Setaria viridis and Lolium sp. were between Pseudomonas viridiflava (Pv.) and P. syringae pv. syringae (Pss.) . The second group consisted of Acalypha sp. which was different from Pv. and Pss. In the third group, the isolate from Amaranthus retroflexus was similar to Pss. The isolates of the fourth group including those from Aegilops ovate and Cynodon dactylon resembled Pv. Polymerase chain reaction (PCR) assays with gyr B and rpo D primers, the specific fragments of 850 bp and 1200 bp long respectively, were amplified from most strains. Multiple sequence alignment was performed using ClustalW software, with sequences of this region of all Pseudomonas species in GenBank (NCBI). The phenotypic tests and PCR assays results showed that the strains belonged to Pseudomonas .The strains isolated from Aegilops ovate and Cynodon dactylon belonged to Pv. and the strains from Amaranthus retroflexus belonged to Pss. Isolates collected from Poa annua, Phalaris canariensis, Sorghum halepense, Setaria viridis and Lolium sp. had some characteristics half way between Pseudomonas viridiflava (Pv.) and P. syringae pv. syringae (Pss.)