كرايوپرزرويشن سلول هاي اپي تليال آمنيون انساني در محيط فاقد سرم

Serum-Free Cryopreservation of Human Amniotic Epithelial Cells

مقدمه و هدف: از مباحث مطرح در نگهداري طولاني مدت سلول ها، حذف سرم حيواني از محيط هاي نگهداري است. در اين مطالعه از مايع آمنيون كه سرشار از فاكتور هاي رشد و مواد غذايي است به عنوان جايگزين سرم حيواني استفاده شد و اثرات استفاده از آن در تعداد سلول هاي زنده و پرتواني سلول ها پس از كرايوپرزرويشن ( نگهداري به روش انجماد) بررسي گرديد. روش كار: در اين مطالعه تجربي پس از تهيه پرده آمنيون و كنترل ميكروبي آن، سلول هاي اپي تليال آمنيون انساني جداسازي گرديد. سلول ها در 24 حالت مختلف در دماي C°196- در نيتروژن مايع به مدت 12 ماه نگهداري شدند و درصد سلول هاي زنده قبل و پس از نگهداري به روش انجماد با روش هاي تريپان بلو و MTT ارزيابي و بيان ماركر Oct-4 به منظور بررسي پرتواني سلول ها قبل و بعد از نگهداري به روش انجماد با روش ايمونوسيتوشيمي بررسي شدند. نتايج حاصل در بين گروه ها با روش ANOVA مقايسه شد (Tukey Post-Test). تفاوت بين نمونه ها در دوسطح P < 0.05 و P < 0.01 بررسي گرديد. نتايج: يافته هاي حاصل نشان داد كه وجود DMEM، FBS و يا مايع آمنيوتيك (بجاي FBS) براي نگهداري بهينه سلولها به روش انجماد ضروري است. تعداد سلول هاي زنده و درصد بيان Oct-4 در مواردي كه مايع آمنيون به جاي سرم استفاده شده بود تغيير معني داري نداشت. همچنين يافته ها نشان داد كه DMSO نسبت به گليسرول ، ماده محافظ بهتري براي نگهداري سلول هاي اپي تليال آمنيوني مي باشد. نتيجه نهايي: نتايج اين مطالعه نشان مي دهد كه مايع آمنيون مي تواند به عنوان جايگزين مناسب براي سرم حيواني در نگهداري به روش انجماد سلول هاي اپي تليال آمنيون انساني استفاده شود.

Introduction & Objective: One of the important issues in long term storage of cells is removal of animal serum from cell culture environments. The aim of this study was to evaluate amni-otic fluid (AF), which is full of growth factors, as substitute for fetal bovine serum (FBS) in the cryopreservation protocol. Materials & Methods: In this experimental study human amniotic epithelial cells were isolated from placentas which were seronegative for microbial infections. The cells were preserved in 24 different patterns for 12 months in -196 ?C (liquid nitrogen) and viability of cells were determined before and after cryopreservation by trypan blue and MTT assay. Moreover, Oct-4 expression was studied to determine pluripotency before and after cryopreservation with immunocytochemistry. Results were compared between groups with ANOVA (Tukey Post-Test). P.value under 0.01 and 0.05 was considered statistically significant. Results: The presence of DMEM, FBS or AF is necessary for amniotic cell cryopreservation. Trypan-blue, MTT and immunocytochemistry showed that there isn’t significant difference between using AF and FBS in viability and pluripotency of cells. Moreover, results showed that DMSO is a better cryoprotectant compared to glycerol. Conclusion : Results showed that amniotic fluid can be a proper substitute for FBS in amniotic epithelial cells cryopreservation. (Sci J Hamadan Univ Med Sci 2013; 20 (1):15-24)