شناسايي و تشخيص ويروس موزاييك معمولي لوبيا و موزاييك نكروتيك معمولي لوبيا با استفاده از روش Immunocapture RT-PCR

Identification and diagnosis of isolates of bean common mosaic viruses and bean common mosaic necrosis viruses by immunocapture RT-PCR

سابقه و هدف: در بين عوامل ويروسي متعددي كه باعث بروز علايم موزاييك و ايجاد خسارت در گياه لوبيا چيتي (Phaseolus vulgaris L. ) ميشوند، دو ويروس موزاييك معمولي لوبيا BCMV و ويروس موزاييك نكروتيك لوبيا BCMNV اهميت ويژه اي دارند . به منظور رديابي اين دو ويروس و تعيين برخي خصوصيات سرولوژيك و مولكولي آنها، در يك فصل زراعي نمونه هايي با علايم موزاييك ، رگبرگ روشني ، برگشتگي ، نكروتيك برگ و ساقه لوبيا جمع آوري گرديد. مواد و روش ها: به منظور رديابي اين دو ويروسدر ابتدا نمونه ها با روشهاي سرولوژيكDAS-ELISA و لكه گذاري بافتي (Tissue-blot) با آنتي سرم هاي چند همسانه اي اختصاصي مورد سنجش و رديابي قرار گرفتند. سپس جهت تاييد و بررسي دقيق تر ، نمونه هاي انتخابي آلوده در الايزا با آزمون IC-RT-PCR مورد ارزيابي قرار گرفتند يافته ها: cDNA بدست آمده در دستگاه ترموسايكلر تكثير گرديد. محصول حاصل در ژل آگاروز الكتروفورز شد..باند حاصل به اندازه تقريبي 373 باز و 683 باز از سكانس منطقه اي از ژن پروتيين پوششي ويروس مورد نظر به ترتيب براي ويروس موزاييك معمولي و ويروس موزاييك نكروتيك معمولي لوبيا مشاهده گرديد.. با بكارگيري تكنيك IC-RT-PCR وبر اساس مقايسه سايز باند هاي ايجاد شده در اين روش ،دو ويروس مذكور ازگياهان لوبياي آلوده مناطق اراك ، نيشابور ، زنجان وكرج شناسايي و تفكيك گرديد. نتيجه گيري:ويروس موزاييك معمولي و موزاييك نكروتيك معمولي لوبيا بطور گسترده اي در اغلب مناطق كشت و كار لوبيا در ايران پراكنده هستند. و در بعضي اوقات نيز به طور مشترك و تواما گياه لوبيا را آلوده ميسازند. نشان داده شده كه تكنيك IC-RT-PCR براي شناسايي و تشخيص اين دو ويروس از حساسيت بالايي نسبت به روش الايزا بر خوردار است. در اين تكنيك بكارگيري همزمان و مخلوطي از آنتي سرم اختصاصي ويروس و پرايمر هاي مربوطه با عث شناسايي و تفكيك همزمان دو ويروس در صورت آلودگي توام خواهد شد .

Aims and scope: Several viruses so far have been reported to be the cause of mosaic and yield losses in French bean (Phaseolus vulgaris L.) in Iran. Among these, BCMV, and BCMNV are more important. During a growing season, French bean plant samples were selected with various symptoms of mosaic, vein clearing, leaf rolling, leaf and stem necrosis were collected from bean cultivation fields. Material and methods: The samples were tested serologically against the two viruses using DAS-ELISA and Tissue blot technique with the specific polyclonal antisera obtained from commercial sources .To confirm the Elisa results, selected Elisa positive samples tested applying IC- RT-PCR using virus specific polyclonal antibody and a specific set of primers designed from virus cp-genes region. Results: The cDNA obtained were multiplied in termocycler machine. The results of agarose gel electrophoresis of approx. 373bp and 683bp band were obtained for part of the cp genes of BCMV and BCMNV. Using IC-RT-PCT both viruses were identified from samples of Arak, Neishabour, Zanjan and Karaj provinces. Conclusion: BCMV and BCMNV are widespread in almost all bean growing regions of Iran and often present in mixture. IC-RT-PCR test for diagnosis and identification of these two viruses is proved to be more sensitive than Elisa test. In this technique combination of a specific antisera and a specific set of primers help in distinguishing the two viruses in mixture.