كلونينگ و بيان ژن كد‏كننده آنزيم لاكاز از باكتري باسيلوس پوميلوس سويه GAZ23

Cloning and Expression of Laccase Enzyme from B. pumilus strain GAZ23

مقدمه: لاكازها (بنزن ديول اكسيژن اكسيدو ردوكتاز EC 1. 10. 3. 2) يكي از اعضاي خانواده مالتي كوپر اكسيدازها هستند كه اكسيداسيون طيف گسترده اي از تركيبات فنولي را با استفاده از اكسيژن مولكولي كاتاليز مي‌كنند. مواد و روش‏‏ها: ژن كد‏كننده آنزيم لاكاز از سويه GAZ23 به‏وسيله پرايمرهاي كلونينگ اختصاصي ژن تكثيرشد. محصول PCR در ناقل بياني (pET21a) كلون به باكتري اشريشيا كلي سويه BL21(DE3) انتقال يافت و تحليل توالي انجام شد. بيان آنزيم با استفاده از سوبستراي معمول لاكاز ABTS سنجيده شد. نتايج: توالي ژن S rDNA16 سويه بومي GAZ23 كه از خاك‏هاي ايران جدا شده است داراي 100 درصد شباهت به باكتري باسيلوس پوميلوس بود. ژن لاكاز در سويه GAZ23 داراي 1533 نوكليوتيد است كه 510 آمينواسيد را كد مي‏كند. بحث و نتيجه‏گيري: ژن لاكاز سويه GAZ23 داراي 67 درصد شباهت آمينواسيدي به پروتيين CotA باكتري باسيلوس سوبتيليس است. به منظور به دست آوردن مقادير بالاي پروتيين محلول، بيان، تحت شرايط ميكروآيروبيك و در دماي پايين انجام شد. 4 دمين غني از هيستيدين متصل شونده به مس در توالي آمينواسيدي اين پروتيين وجود دارد.

Introduction: Laccases (benzene diol oxygen oxidoreductase: EC 1.10.3.2 are one of the multicopper oxidase family members that catalyze the oxidation of various phenolic compounds by using molecular oxygen Materials and methods Laccase gene was from strain GAZ23 amplified by cloning primers. PCR product cloned in the expression vector (pET21a) and transferred to BL21 strain of E. coli and sequence analysis were carried out. Biochemical properties were investigated using common laccase substrates, 2,2?-azino-bis(3-ethylbenzothioazolin-6-sulphonicacid )ABTS). Results: 16S rRNA gene of strain GAZ23 isolated from Iran soils, showed high similarity to Bacillus pumilus (100%). The gene of the GAZ23 has an open reading frame composed of 1533 bases, which encode 510 amino acid residues. Discussion and conclusion: The laccase gene from GAZ23 shows 67% similarity with CotA from B. subtilis. The expression was performed under microaerobic condition and decreased temperature in order to obtain high amounts of soluble protein. This protein contains four histidine rich copper-binding domains. Key words: laccase, CotA protein, B. pumilus, Gene expression