كشت كراتينوسايت هاي انساني در محيط كشت عاري از سرم

Culture of human keratinocytes in serum free medium

چكيده زمينه و هدف: سلول هاي كراتينوسايت انساني ابزار مفيدي جهت انجام مطالعات سلول درماني به منظور بهبود سوختگي ها و زخم هاي مزمن محسوب مي شوند. همچنين كراتينوسايت ها با كارايي بالا به سلول هاي پرتوان القايي تبديل مي شوند. در اين مطالعه جزييات مربوط به روش هاي جداسازي، كشت و تكثير سلول هاي كراتينوسايت از نمونه پوستي ختنه گاه انسان، توصيف شده است. روش بررسي: در اين مطالعه كه از نوع آزمايشگاهي، و مشاهده اي بود. نمونه مربوط به پوست ختنه گاه نوزاداني كه به تازگي ختنه شده بودند تحت شرايط استريل به آزمايشگاه منتقل شد. از آنزيم ديسپاز جهت جداسازي اپيدرم از درم و از آنزيم تريپسين براي جداسازي سلول هاي كراتينوسيت موجود در لايه اپيدرم استفاده شد. سلول ها در ظروف كشت پوشش داده شده با كلاژن نوع I انساني و محيط كشت اپي لايف عاري از سرم، كشت داده شدند. ارزيابي هاي مورفولوژيك و ايمونوسيتوشيمي جهت تاييد ماهيت سلول هاي جداسازي شده انجام شد. يافته ها: نتايج ارزيابي هاي انجام شده نشان داد كه سلول هاي جداسازي شده داراي مورفولوژي تيپيك كراتينوسايت ها بوده و آنتي ژن اختصاصي كراتينوسايت ها CK14 را هم بيان مي كنند. هر 4 الي 5 روز يكبار سلول ها به نسبت 1 به 2 پاساژ داده شدند. بعد از پاساژ 10 تكثير سلول ها به شدت كاهش يافته و از نظر مورفولوژيك ظاهري پهن و نازك پيدا كردند. نتيجه گيري: در اين مطالعه نحوه جداسازي و تكثير كراتينوسايت هاي انساني مشتق از نمونه پوستي ختنه گاه انسان در آزمايشگاه بهينه سازي شد. از آنجاييكه بيش از بيست بار سلول ها با موفقيت جداسازي شدند مي توان نتيجه گرفت ، روش معرفي شده در اين مقاله كه نسبت به روش هاي پيشين همراه با مقداري تعديل و بصورت جزيي تري توصيف شده است در آزمايشگاه هاي ديگر نيز تكرار پذير است. كليد واژه ها: كراتينوسايت هاي انساني، نمونه پوست ختنه گاه انسان، سايتوكراتين 14، محيط عاري از سرم

ABSTRACT Background and Aim: Keratinocytes are useful for cellular transplantation studies in order to improve functional outcome in burn patients and chronic wounds. Recently they have been used for generation of iPS cells with high efficiency. In this study, we described the details on separation, culture and proliferation of human keratinocytes from foreskin samples. Material and Method: In this experimental and qualitative study we obtained neonatal foreskin samples following newborn circumcision under sterile conditions. We used dispase enzyme to separate the epidermis from the dermis. Trypsin enzyme was used for isolation of keratinocyte cells from the epidermis layer. Isolated cells were cultured in type I human collagen-coated dishes and serum-free Epilife medium. We assessed morphological and immunocytochemical aspects of the isolated cells. Results: Morphological and Immunocytochemical analyses revealed that isolated cells have typical keratinocyte morphology and they could express CK14 which is a specific marker of the keratinocytes. The cells were successfully sub-cultured at a split ratio of 1:2 every 4 to 5 days. After passage 10, a significant decrease in the proliferation of the human keratinocyte cells was observed. Morphologically the cells were flat and thin. Conclusion: In this study we improved the method of isolation and cultivation of human keratinocyte from foreskin. Using this method, we isolated human keratinocytes for more than 20 times. Thus, it can be concluded that this method is reproducible in other laboratories. Keywords: Human keratinocytes, Foreskin, Cytokeratin 14, Serum free medium.