طراحي و مهندسي ساختار پلي سيترونيك قطعه F(ab`)2 آنتي بادي ضدگيرنده HER2 جهت بيان در ميزبان باكتريايي

Ligation Independent Cloning of Polycistronic, Genetically Modified, HuMAb4D5-8 F (ab`)2, in Bacterial Plasmid

مقدمه: در سال هاي اخير، آنتي‌بادي‌هاي منوكلونال نوتركيب و مشتقات آنها به عنوان يكي از مهم‌ترين عوامل هدف درماني در نظر گرفته شده‌اند. آنتي‌بادي‌هاي منوكلونال به صورت رايج در ميزبان پستانداران توليد مي‌شوند كه هزينه‌هاي توليد در اين ميزبان بسيار بالاست و در نتيجه قيمت داروهاي اين گروه درماني مهم بالا بوده كه به مصرف كنندگان اين داروها هزينه بالايي تحميل مي‌شود. به اين منظور انتخاب يك سيستم توليدي ارزان و راحت مثل ميزبان‌هاي باكتريايي براي كاهش هزينه توليد اين محصولات به عنوان يك سرفصل بزرگ براي موضوعات در حال رشد در سيستم‌هاي بيان مواد نوتركيب به شمار مي‌رود. روش بررسي: در اين مطالعه، يك ساختار پلي سيتروني از قطعه F(ab`) 2 از آنتي HER2 كه قادر به بيان درد در سيستم باكتريايي باشد طراحي شد. همچنين در ساختار ناحيه لولاي آنتي بادي تغييراتي داده شد تا اين قطعه به شكل صحيح بيان شده و تابخورد و از تشكيل انواع مختلفي از ساختارهاي هتروژنو غيرفعال جلوگيري شود. نهايتاً ساختار ژني سنتز شده در حامل باكتريايي، بدون استفاده از روش‌هاي معمول كلون سازي و به صورت مستقيم وارد شد. يافته ها: ساختار پلي سيترونيك قطعه F(ab`)2 آنتي‌بادي ضدگيرنده HER-2 به خوبي طراحي شد. تمامي اجزاي لازم جهت رونويسي، ترجمه، تاخوردگي مناسب، شناسايي و خالص سازي در نظر گرفته شد. اصلاحات ناحيه لولا جهت به طور موفقيت آميزي انجام گرفت. كاستژني F(ab`)2 با پرايمرهاي اختصاصي تكثير شد. كاست بيان شونده حاصل با موفقيت در داخل حامل پلاسميدي PET-32 EK/LIC و در جايگاه LIC اضافه شد. نتيجه گيري: نتايج اين مطالعه نشان مي دهد كه قطعه F(ab`)2 اصلاح شده با استفاده از روش كلون سازي غيروابسته به اتصال به طور موفقيت آميزي وارد حامل بياني E.coli شد. اگرچه مطالعات انجام شده در زمينه طراحي و توليد قطعه F(ab`)2 بسيار محدود است، نتايج اين تحقيق نشان مي دهد كه ميزبان هاي باكتريايي مسيرهاي جايگزين مناسب و سيستم بياني مقرون به صرفه از نظر اقتصادي براي توليد قطعات آنتي بادي هستند.

Background: Over the recent years, the recombinant monoclonal antibodies and their derivatives are considered among the key elements of targeted therapy. Monoclonal antibodies are regularly expressed in mammalian cells and the costs of their commercial production are too high. Accordingly, the final price of drugs thus produced is high – what further adds to the financial pressures on consumers. Therefore, finding an easy and cheap mechanism such as bacterial hosts to reduce the costs for producing similar products is a main objective in the field of studying the expression systems of recombinant monoclonal antibodies. Methods: In the present research, a polycistronic construct of F(abʹ)2 Fragment of anti HER-2 antibody which can be expressed in a bacterial system has been designed. Also, changes have been applied in the antibody hinge region to increase the efficiency of its expression as well as its bending so as to prevent the development of inactive and heterogenic constructs. Eventually, the designed construct was cloned in pET-32 Ek/LIC vector without using the regular cloning methods. Results: Polycistronic construct of anti HER-2 F(abʹ)2 fragment was designed successfully. All components for transcription, translation, proper folding, identification and purification were considered. Hinge region modifications were performed successfully. F(abʹ)2 region amplified by specific primers. Expression cassette was cloned into the framework of the E.coli plasmid pET-32 Ek-LIC vector at the LIC site, successfully. Conclusion: The results of this study showed that modified F(abʹ)2 fragment was inserted in E. coli using the Ligation Independent Cloning technology simply and successfully. Although the rate of studies regarding F (abʹ) 2 fragment design and production in bacterial hosts are very limited, the results of these pieces of research suggest that these hosts are alternative routes and potentially more economical expression systems for the production of antibody fragments. Keywords: Recombinant antibody, cloning, Polycistronic construct, Bacterial Host, Her2 Receptor.