انتقال ژن لوسيفراز حشره شب‌تاب گونه ايراني Lampyris turkestanicus با نشر نور قرمز به گياه بنفشه آفريقايي (Saintpaulia ionantha)

Transformation of iranian firefly Lampyris turkestanicus luciferase gene with red emitting light into african violet plant

آنزيم لوسيفراز حشره شب‌تاب (luc) يكي از مهم‌ترين آنزيمهاي صنعتي است كه به طور وسيع در زمينه‌هاي مختلف پزشكي، بيوتكنولوژي و بيولوژي سلولي و مولكولي كاربرد دارد. اين آنزيم، به دليل داشتن خصوصياتي هم چون حساسيت بالا، تكرارپذير بودن و قابليت اندازه‌گيري كمي آن، كانديداي بسيار مناسبي در زمينه تصويربرداريهاي بيولومينسانس در شرايط طبيعي و در سيستمهاي گزارشگر مي‌باشد. تحقيق حاضر جهت ساب‌كلونينگ و انتقال ژن لوسيفراز حشره شب‌تاب گونه ايراني L. turkestanicus با نشر نور قرمز در گياه بنفشه آفريقايي (Saintpaulia ionantha) انجام گرفت. بدين منظور ژن لوسيفراز (luc) با استفاده از واكنش زنجيره‌اي پليمراز (PCR) با آغازگرهاي اختصاصي از ناقل pET 28a جداسازي و در ناقل بياني pCAMBIA1304 اتصال گرديد. ناقل نوتركيب جديد (pCAMLUC) با استفاده از بررسيهاي Colony PCR،PCR ، هضم آنزيمي، توالي‌يابي و هم رديف‌سازي آن در بانك اطلاعاتي (GenBank)، مورد تاييد قرار گرفت. ژن هدف به كمك آگروباكتريوم سويه LBA4404 به گياه بنفشه آفريقايي منتقل گرديد و گياهان تراريخت بر روي محيطهاي كشت انتخابي حاوي آنتي‌بيوتيكهاي هيگرومايسين و سفوتاكسيم باززا شدند. آناليزهاي PCR و RT-PCR حضور ژن در ژنوم گياه و نسخه‌برداري از آن را تاييد كرد. همچنين نتايج حاصل از سنجش لومينومتري، فعاليت آنزيم لوسيفراز را در بافتهاي برگي بعضي از گياهان نشان داد. در اين سنجش حداكثر نور نشر شده RLU/sec 20000 بود در حالي كه در گياهان شاهد نشر نوري سنجيده نشد.

Firefly luciferase (luc) is one of the most important industrial enzymes which have various applications in medicine, biotechnology and molecular biology. luc is also a suitable candidate both in in vivo bioluminescence imaging and reporter systems, due to having interesting features such as high sensitivity, reproducibility, and being measured quantitatively. In this study, Iranian firefly Lampyris turkestanicus luciferase gene with red emitting light was subcloned and introduced into African violet (Saintpaulia ionantha) plants. The luc gene was isolated by PCR, and was subcloned in pCAMBIA1304 vector. The construct was confirmed by several methods: colony PCR, PCR, digestion, sequencing and BLAST analysis. The Agrobacterium–mediated transformation method was used to introduce luc into African violet genome and putative transgenic plants were selected on the selective medium containing hygromycin and cefotaxim. Finally, transgenic plants were confirmed by PCR, RT-PCR and Luminometric analysis. The results of luminometric assay showed the activity of luciferase enzyme in the leaves of some plants. In this study, the maximum emitted light was 20000 RLU/sec, while in the control plant, the light emission was not detected.