تشخيص گونه‏هاي كريپتوسپوريديوم جدا شده از انسان با روش PCR-RFLP در تهران

The identification of Human Cryptosporidium Species in Tehran by PCR/RFLP

هدف: كريپتوسپوريديوزيس از عفونت‏هاي انگلي شايع در ايران و به‏عنوان عامل ايجاد اسهال در انسان و دام به‏شمار مي‏آيد. از اين رو شناسايي گونه‏هاي شايع آن در جمعيت‏هاي انساني ضروري است. هدف از انجام مطالعه حاضر تعيين گونه‏هاي كريپتوسپوريديوم جدا شده از بيماران مراجعه كننده به سه بيمارستان در تهران بر مبناي ژن 18s rRNA با استفاده از روش Nested PCR-RFLP است. مواد و روش‏ها: مطالعه حاضر از نوع توصيفي- مقطعي بوده و در مرحله اول جمعاً 1128 نمونه مدفوع انساني از بيماران مراجعه كننده به سه بيمارستان علي اصغر، مفيد و امام خميني در تهران جمع‏آوري شد. سپس نمونه‏ها با روش اسيد فاست تغيير يافت و رنگ‏آميزي و تشخيص داده شد. در مرحله دوم DNA نمونه‏هاي مثبت استخراج و ژنs rRNA 18 با روش Nested-PCR تكثير، سپس براي تشخيص گونه، محصول PCR با آنزيم محدود كننده Vsp1 برش داده شد در نهايت محصول PCR تعيين ترداف شد. نتايج: از نمونه‏هاي رنگ‏آميزي شده با ذيل نلسون تعداد 12 نمونه (06/1 درصد) مثبت تشخيص داده شد. همه اين نمونه‏ها با روش Nested-PCR تاييد شد. قطعه تكثير يافته 845 جفت‏بازي ژن 18s rRNA با آنزيم Vsp1 برش داده شد. پس از برش آنزيمي روي ژل آگارز 5/2 درصد، 10 نمونه به‏عنوان كريپتوسپوريديوم پاروم و بر مبناي الگوي برش آنزيمي و ترادف بازي يك نمونه به‏عنوان كريپتوسپوريديوم آندرسوني و يك نمونه به‏عنوان كريپتوسپوريديوم هومنيس تشخيص داده شد. نتيجه‏گيري: گرچه گونه پاروم به‏عنوان گونه شايع در انسان‏ها شناخته شده است ولي ممكن است افراد به گونه هومنيس و آندرسوني نيز مبتلا شوند.

Objective :Cryptosporidiosis is one of the most important parasitic infections in Iran which causes diarrhea in humans and animals. The identification of the Cryptosporidium species among humans is necessary. This study aims to identify species of Cryptosporidium isolated from patients that referred to three hospitals in Tehran based on the 18s rRNA gene by nested PCR-RFLP assay. ‎Methods :In the first step of the present descriptive cross-sectional study, 1128 human fecal samples were collected from patients that referred to three hospitals (Ali Asgar, Mofid and Imam Khomeini) in Tehran. The samples were examined for ‎Cryptosporidium by modified acid fast staining. In the second step, DNA of the ‎positive samples were extracted, then gene of 18s rRNA was amplified by ‎nested PCR in order to differentiate between species. The PCR products were subsequently digested by Vsp1 restriction enzyme and their sequences determined. Results: The modified acid fast method detected 12 (1.06%) positive samples which was confirmed by a molecular technique. The 845bp fragment of 18s rRNA was digested ‎by restriction enzymes. There were 10 samples identified as Cryptosporidium parvum that showed ‎similar patterns on 2.5% agarose gel; 2 other samples were identified as Cryptosporidium homonis and Cryptosporidium andersoni based on the different patterns and sequence results. Conclusion: Although Cryptosporidium parvum is introduced as the major agent for ‎cryptosporidiosis in humans, Cryptosporidium hominis and Cryptosporidium andersoni may also infect humans.