مطالعه و ارزيابي كلون كردن ژن آنزيم L-آسپاراژينازΙΙ Escherichia coli در Bacillus subtilis

Study and Evolution Cloning of the Gene Encoding the L-AsparaginaseΙΙ from E. coli in B. subtilis

سابقه و هدف: ال-آسپاراژيناز ?? كاربرد موثري در درمان لوسمي لنفوبلاستيك (ALL) دارد. اين آنزيم از منابع باكتريايي جدا شده و به صورت تجاري به عنوان داروي ضدسرطان عرضه مي شود. سلول هاي سرطاني برخلاف سلول هاي نرمال، نياز شديدي به ال-آسپاراژين دارند، در صورت به كارگيري ال-آسپاراژيناز ?? (E.C. 3.5.1.1) ال-آسپاراژين به ال-آسپارتات و آمونيوم تبديل مي شود كه در نهايت به تخريب سلول هاي سرطاني منجر مي شود. هدف از اين پژوهش، كلون-كردن ژن ال-آسپاراژيناز ?? E. coli در B. subtilis جهت توليد انبوه اين آنزيم انجام گرفت. مواد و روش ها: ژن ال-آسپاراژيناز ?? (ansB) با روش PCR از E. coliBL21 جدا گرديد. قطعه تكثير يافته و شاتل وكتور بياني pMR12 توسط آنزيم هاي Hind???، BamH? هضم شد. واكنش اتصال بين قطعه ي PCR و شاتل وكتور بياني برش خورده با روش استاندارد انجام گرفت. در مرحله ي بعد، وكتور نوتركيب با روش شوك با CaCl2 سرد بهE. coliJM101 ترانسفورم شد. در نهايت به ميزبان B. subtilis با روش شيميايي انتقال يافت. يافته ها: در اين مطالعه، ژن ansB به وسيله PCR از E. coliBL21 جدا و توسط تجزيه و تحليل آنزيمي محصول PCR تاييد گرديد و در شاتل وكتور بياني pMR12 كلون شد. سپس وكتور نوتركيب ابتدا در E. coli كلون گرديد و وجود ژن 1047 bp با تجزيه و تحليل آنزيمي و واكنش PCR تاييد شد به دنبال آن داخل B. subtilis كلون شد و استخراج پلاسميد انجام گرفت و با باند شاتل وكتور بياني pMR12 داراي ژن ansB به صورت صحيح، مقايسه و تاييد گرديد. نتيجه گيري: در اين تحقيق با استفاده از شاتل وكتور بياني pMR12 ژن ansB را در B. subtilis كلون شد. اين مطالعه، اولين گزارش كلونينگ ژن ansB در B. subtilis است.

Background and purpose: L-asparaginase?? (E.C. 3.5.1.1) has effective usage for treatment of acute lymphoblastic leukemia. This enzyme is isolated from bacterial sources and it is commercially available as an anti-cancer drug. This enzyme catalyzes the hydrolysis of L-asparagine to ammonium and aspartate. Unlike Normal cells, the cancer cells strongly require L-Asparagine leading to destruction of these cells. The propose of this project is cloning of L-asparaginase?? gene from E. coli in B. subtilis to produce the mass of this enzyme. Materials and methods: L-asparaginase?? gene is isolated from E. coli by PCR approach. The amplified fragment and expression shuttle vector pMR12 are digested by Hind??? and BamH? enzymes. The ligation between DNA fragment and the cloning shuttle vector is done by standard method. In the next step recombinant vector is transferred to E. coli JM101 by cold calcium chloride treatment and finally introduced into B. subtilis by a chemical method. Results: in this experiment, ansB gene is isolated from E. coli by PCR and cloned into the expression shuttle vector pMR12. Existence of gene with 1047 bp lenght is confirmed by enzymatic analysis and PCR reaction. Then recombinant vector cloned in E. coli at first and then in B. subtilis. Finally the plasmid extracted and compared with the band of expersion shuttle vector containing ansB gene to confirm. Conclusions: In this study, we tried to clone the ansB gene in B. subtilis using expression shuttle vector pMR12. This is the first report of ansB gene cloning in B. subtilis