ارايه روش معتبرسازي اندازه‌گيري اسيدفوليك در آرد و نان غني‌شده به روش كروماتوگرافي مايع با كارايي بالا (HPLC) با به‌كارگيري دتكتور فلورسانس

AN IMPROVED SIMPLE AND PRECISE HPLC METHOD FOR DETERMINATION OF FOLIC ACID IN FORTIFIED WHEAT FLOURS AND BREADS WITH FLUORESCENCE DETECTION

پيش‌زمينه و هدف: عمل غني‌سازي آرد به‌عنوان مناسب‌ترين حامل جهت جبران كمبود آهن و اسيدفوليك در جيره غذايي، در سال‌هاي اخير موردتوجه مسيولين بهداشت قرار گرفته است و از آنجايي كه موضوع كنترل كيفي و كمي مواد غذايي از مباحث مهم در ارتباط با سبد غذايي افراد در هر جامعه محسوب مي‌شود لذا در اين خصوص لازم است تا انواع مواد موجود در مواد غذايي ازجمله اسيدفوليك مورد آناليز واقع گردد. روش‌هاي متعددي براي اندازه‌گيري اسيدفوليك در مقالات علمي ارايه گرديده است، ولي عملاً" روش دقيق، آسان و مورداطميناني تابه‌حال در ايران گزارش نشده است كه در اين تحقيق با توجه به مطالعات انجام‌يافته و بررسي مقالات متعدد در اين زمينه، روش كروماتوگرافي مايع با كارايي بالا با استفاده از دتكتور فلورسانس به دليل حساسيت بالا براي آناليز ميزان اسيدفوليك در نمونه‌هاي آرد و نان غني‌شده طراحي گرديد. مواد و روش‌ها: از آنجايي كه اسيدفوليك خاصيت فلورسانس نداشته ما در اين پروژه سعي نموديم ساختمان شيميايي اين ويتامين را به كمك پرمنگنات به فرم فليوروفور تبديل نمايي‌ام. در اين روش، پس از رسم منحني كاليبراسيون استاندارد و استخراج اسيدفوليك از نمونه آرد و نان، ميزان آن توسط دستگاه HPLC مورداندازه‌گيري قرار مي‌گيرد. جهت تشخيص و اندازه‌گيري مقادير اسيدفوليك از دتكتور فلورسانس با طول‌موج تحريكي 296 نانومتر و طول‌موج نشري 440 نانومتر استفاده گرديد. زمان بازداري براي اسيدفوليك 07/1 دقيقه به دست آمد. به‌عنوان فاز متحرك مخلوطي از متانول و آب ديونيزه به نسبت 20 به 80 استفاده شد. سرعت جريان فاز متحرك 1 ميلي‌ليتر در دقيقه تنظيم گرديد. سيستيم HPLC شامل يك پمپ گراديانت، ستون از نوع C18 به طول 10 سانتيمتر و قطر 6/4 ميلي‌متر بود. يافته‌ها: منحني كاليبراسيون در فاصله غلظتي 8-1/0 ميكروگرم بر ليتر در محدوده خطي قرار دارد و در اين روش حد تشخيص 03/0 ميكروگرم بر ليتر حاصل گرديد. منحني جذب اسيدفوليك در زمان 12/1 دقيقه ظاهر گرديد. نتايج آناليزها نشان دادند كه ضريب تغييرات درون روزي براي 3 غلظت ذكرشده، بين 37/2 – 07/0 ميكروگرم بر ليتر 5 قرار داشت. براي تغييرات بين روزي نيز 3 غلظت مختلف ذكرشده موردبررسي قرار گرفتند. نتايج آناليز آن‌ها نيز نشان داد كه ضريب تغييرات بين روزي بين 82/7 –09/3 ميكروگرم بر ليتر قرار داشت. اين آزمايش‌ها سه بار بر روي هر نمونه انجام شد. بررسي نتايج نشان‌دهنده استخراج حدود 72درصد در نمونه‌هاي آرد و نان هست. مقدار اسيدفوليك در آردها و نان‌ها به ترتيب 102 و 85 ميكروگرم بر 100 گرم را نشان مي‌دهد كه گوياي كاهش 67/16 درصدي از مقدار اسيدفوليك در طي پروسه تهيه نان مي‌باشد. نتيجه‌گيري: روش ما نشان داد كه مي‌تواند به‌عنوان يك روش آناليز براي كنترل و اندازه‌گيري مقدار اسيدفوليك در آردهاي غني‌شده در آزمايشگاه‌هاي كنترل غذا و دارو به‌عنوان يك روش ساده و دقيق براي تعيين مقدار اسيدفوليك مورداستفاده قرار گيرد. نتايج حاصل از آناليزها در خصوص ميزان تكرارپذيري، صحت و دقت روش، ميزان درصد بازيافت و حد تشخيص روش، همگي بيانگر اعتبار علمي و عملي اين روش آناليز مي‌باشند و نيز همخواني نتايج به‌دست‌آمده با نتايج ساير منابع علمي تاييد كننده اين مسيله مي‌باشد.

Background & Aims: Folic acid is one of the important hematopoietic agents necessary for proper regeneration of the blood forming elements and their functioning. Since humans cannot synthesize folates, they must be obtained from dietary sources. The most important dietary sources of folates are fortified foods and cereal products with folate content of 50-200 ?g/100 g. In Iran the majority of people consume bread as an ideal food because of its low price and availability. The objective of this study was to develop a simple and precise High Performance Liquid Chromatography (HPLC) method for determination of folic acid in enriched wheat flours and bread. Materials & Methods: The method combines several procedures including an extraction technique, oxidation of folic acid to increase fluorescent properties, and an improved HPLC with fluorescence detection method. The method was performed on a C18 analytical column. The mobile phase consisted of a mixture of methanol and pure water (20/80).The elute was continuously monitored using a fluorescence detector (?ex 296 nm and ?em 440 nm). Results: The standard curve for folic acid passed through the origin and was linear over the range 0.1 – 8µg/L. The peak of folic acid appeared as sharp with retention times of 1.12 minutes. The intra-day coefficient of variation was evaluated in the range of 3.09-7.82 µg/L. The Inter day coefficients of variation for the method ranged between 2.37 and 5.07 µg/L. The accuracy of the method ranges between 99.2% and 103.7% for intra-day analysis and 98.8% and 106.9% for inter-days analysis. The limit of determination for folic acid was 0.03µg/L. The mean concentration of folic acid was 102 µg and 85 µg per 100 gram of flour and bread respectively. The amount of folic acid was decreased during preparation and fermentation process (16.67%). Conclusions: The obtained results indicated that this method is a rapid, sensitive, and precise technique for measurement of folic acid in enriched wheat flours and breads.