جداسازي و كلونينگ ژن انساني MAGEA4 در پلاسميد بياني pRUF

Isolation and Cloning of MAGEA4 human gene into pRUF expression plasmid

سابقه و هدف: كنسر تستيس آنتي ژن ها دست هاي از آنتي ژن ها مي باشند كه به طور ويژه بيان آن ها در سلول هاي زايا و انواع مختلفي از سرطان ها ديده شده است. يكي از اعضاي اين خانوادهMAGEA4 مي باشد كه اين آنتي ژن با انواع تومورها در ارتباط است. از آنجا كه عملكرد اين ژن هنوز به درستي مشخص نشده است، هدف از اين مطالعه تكثير و كلونينگ اين ژن در وكتور بياني به منظور توليد پروتيين نوتركيب بيان كننده MAGEA4 است. مواد و روش ها: از طريقPCR و با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي حاوي برش آنزيم محدود كننده ژن MAGEA4 تكثير شد. محصول PCR خاص شده بين سايت هاي BamH1 وXho1 وكتور pTZ57/R قرار گرفت و در سويه Top10 اشرشياكلي ترانسفورم گرديد و توسط IPTG وX-Gal غربالگري شد. صحيح قرا گرفتن قطعه MAGEA4 توسط برش آنزيمي و تعيين توالي بررسي گرديد. سپس ساب كلونينگ اين ژن در وكتور بياني pRUF با همان جايگاه هاي برش آنزيمي صورت پذيرفت. يافته ها: تاييد نهايي از طريق PCRكلني و برش آنزيمي، تعيين توالي صورت گرفت. بنابراين ژنMAGEA4 در جايگاه برشي آنزيمي پلاسميد pRUF كلون شد. نتايج: مطالعه حاضر گام مهمي جهت توليد پروتيين نوتركيب و استفاده از آن جهت پي بردن به عملكرد اين ژن و اهداف درماني به منظور درمان سرطان مي باشد.

Aim and background: Cancer/testis (CT) antigens are a category of tumor antigens that are typically expressed only in the human germ line, and in several types of tumor. MAGEA4 is one member cancer testis antigen family that has relation with other tumors. Since the biological function of MAGEA4 is unclear, the aim of the present study was amplification and cloning of the gene in the expression vector to produce recombinant protein that expresses MAGEA4. Material and method: Using PCR specific primers including restriction site, MAGEA4 was amplified. The purified PCR products were ligated between the BamH1 and Xho1 sites of pTZ57/R cloning vector and transformed into Escherichia coli Top10 strain and screened by IPTG and X-Gal. The correct orientation of MAGEA4 fragment was identified by restriction enzyme analysis and sequencing of constructed plasmid. Then sub cloning was carried out within pRUF expression vector with the same restriction site. Result: The final confirmation was performed using colony PCR, double digesting and sequence analysis. Therefore the MAGEA4 gene was cloned into the restriction site of pRUF. Conclusion: This study is an important step for producing recombinant proteins and is used to find the function of this gene for therapeutic targets