ساخت شاتل وكتور بياني براي باكتري هاي اشريشيا كلي و باسيلوس سابتيليس

Construction of an expression shuttle vector for Escherichia coli and Bacillus subtilis

سابقه و هدف: باسيلوس سابتيليس به دليل ويژگي هاي غيربيماري زا بودن و توانايي ترشح مقادير بالاي پروتيين، به عنوان يك ميزبان خوب براي كلون سازي ژن و بيان پروتيين در نظر گرفته مي شود. اما كارايي انتقال DNA پلاسميدي اتصال يافته به درون سلول هاي باسيلوس سابتيليس مستعد در مقايسه با سلول هاي اشريشيا كلي مستعد شده با كلريد كلسيم پايين مي باشد. بنابراين بهتر است مراحل اوليه كلون سازي با استفاده از يك شاتل وكتور در اشريشيا كلي انجام شود و سپس باسيلوس سابتيليس با مقدار زيادي از وكتور هيبريد ترانسفورم گردد. اين مطالعه با هدف ساخت يك شاتل وكتور با استفاده از پلاسميدهاي pWB980 و pET-16b به منظور كلون سازي و بيان ژن در باسيلوس سابتيليس انجام شد. مواد و روش ها: پلاسميد pWB980 به روش ليز قليايي از ميزبان خود جداسازي شد. به منظور دست يابي به قطعه مورد نظر با استفاده از آنزيم هاي برش دهندهEcoRI و SnaBI هضم دوگانه انجام شد. سپس يك توالي نوكليوتيدي ويژه از پلاسميد pET-16b نيز به وسيله ي PCR تكثير شد و مورد هضم دوگانه قرار گرفت. در مرحله بعد با انجام واكنش اتصال بين اين دو قطعه پلاسميدهاي ايجاد شده به اشريشيا كلي TOP10 منتقل شدند. در نهايت سلول هاي داراي شاتل وكتور غربالگري و پس از استخراج پلاسميد با يك روش مناسب به باسيلوس سابتيليس WB600 منتقل گرديد. يافته ها: شاتل وكتور حاصله به سادگي در هر دو ميزبان همانندسازي كرد. اين پلاسميد در باسيلوس سابتيليس ثبات مناسبي از خود نشان داد كه در حفظ آن در ميزبانش بسيار سودمند است. نتيجه گيري: شاتل وكتورpMR12 به دليل داشتن 8 جايگاه منحصر به فرد در پلي لينكر و با اندازه مناسب kb 5/4 مي تواند يك سيستم كارآمد به منظور كلون سازي آسان ژن محسوب گردد. اين اولين گزارش از ساخت يك شاتل وكتور بياني براي اشريشيا كلي و باسيلوس سابتيليس در ايران مي باشد.

Background and Objectives: Bacillus subtilis is considered as a suitable host for gene cloning and protein expression due to non-pathogenicity and ability to secrete high amounts of proteins. However, transformation efficiency of ligated plasmid DNA into competent cells of B. subtilis is low, as compared to that into CaCl2 shocked cells of Escherichia coli. Therefore, cloning the target in E. coli using a shuttle vector before transfer into B. subtilis by a high amount of hybrid vector is more efficient. The aim of this study is construction a shuttle vector using pW980 and pET-16b plasmids for gene cloning and expression in B. subtilis. Materials and Methods: pWB980 plasmid was isolated from its host using alkaline lysis method. It was undergone a double digestion to obtain the segment of interest using EcoRI and SnaBI enzymes. Then a special fragment of pET-16b plasmid was also amplified by PCR and was double digested. Ligation reaction was performed between these two segments and then it was transferred to E. coli TOP10. Following screening the cells containing shuttle vector, plasmid was extracted and was transferred to B. subtilis WB600 by an effective method. Results: The resulting shuttle vector replicated easily in both hosts. It showed good stability in B. subtilis, which is helpful for its maintenance in its host. Conclusion: In this study, the resulting shuttle vector - pMR12 - had 8 unique cloning site in its polylinker and a suitable size (5.4 kb), which make it possible to simply gene cloning into it. This is the first report of construction of an expression shuttle vector for Escherichia coli and Bacillus subtilis in Iran.