مقايسه دو روش متفاوت انجماد شيشه‌اي بافت تخمدان موش نابالغ با استفاده از رنگ‌آميزي تريپان بلو

Comparison of Two Different Immature Mouse Ovarian Vitrification Methods using Trypan Blue Staining

روش‏هاي انجمادي متفاوتي براي انجماد بافت تخمدان بيماران در معرض خطر ناباروري استفاده مي‏شود. اتيلن گليكول، دي متيل سولفوكسايد و پروپانديول، با خاصيت تشكيل كريستال‏هاي يخ كمتر به‏عنوان محلول‏هاي انجمادي نفوذپذير پايه‏اي در مقايسه با انواع ديگر توصيه شده‏است. در مطالعه حاضر آثار دو روش انجماد شيشه‏اي متفاوت روي بافت كامل تخمدان موش نابالغ با استفاده از رنگ‏آميزي تريپان بلو بررسي شد. مواد و روش‏ها: تخمدان موش‏هاي 8 روزه نژاد NMRI، پس از جداسازي در گروه‏هاي كنترل غير انجمادي، انجمادي 1 و انجمادي 2 دسته‏بندي شدند. محلول انجمادي 1 از محيط پايه ?-MEM، اتيلن گليكول15 درصد، دي متيل سولفوكسايد 15 درصد، سرم جنين گاوي 20 درصد و محلول انجمادي 2 از محيط پايه، اتيلن گليكول 20 درصد، پروپانديول 20 درصد و سرم جنين گاوي 15 درصد تشكيل شد. روش‏هاي انجمادي1 و انجمادي 2 به‏ترتيب در دماي 4 درجه سانتي‏گراد و دماي اتاق انجام شدند. مراحل ذوب در روش انجمادي 1 با استفاده از محيط پايه، سرم جنين گاوي 20 درصد و سوكروز 1 مولار و در روش انجمادي 2 با بهره‏برداري از محيط پايه، سرم جنين گاوي 15 درصد و غلظت‏هاي كاهشي سوكروز (1، 5/0 و 25/0 مولار) انجام شد. تخمدان‏ها در محيط پايه و رنگ تريپان بلو 4/0 درصد به‏مدت 20 دقيقه انكوبه، به‏وسيله بوين تثبيت و در نهايت برش‏هاي بافتي سريالي بعد از رنگ‏آميزي هماتوكسيلين و ايوزين به‏وسيله ميكروسكوپ نوري شمارش شد. نتايج: درصد زيادي از فوليكول‏هاي بدوي در گروه كنترل غير انجمادي مشاهده شد و اختلاف معني‏داري (05/0 > P) بين گروه كنترل غير انجمادي و انجمادي 1 و همچنين بين انجمادي 1 و انجمادي 2 مشاهده شد. افزايش معني‏داري هم در شاخص زنده‏ماني هر سه دسته فوليكولي در گروه انجمادي 2 (05/0 > P) نسبت به انجمادي 1 مشاهده شد. نتيجه‏گيري: انجماد شيشه‏اي با استفاده از تركيب اتيلن گليكول و پروپانديول گزينه مناسب‏تري براي حفظ و نگهداري بافت تخمدان است و همچنين روش رنگ‏آميزي تريپان بلو، به‏عنوان يك شيوه سريع و آسان براي ارزيابي بافت تخمداني پيشنهاد مي‏شود.

Different cryoprotectants are used for cryopreservation of ovarian tissue in patients at risk of infertility. Ethylene glycol (EG), dimethyl sulfoxide (DMSO) and propanediol (PROH) have been chosen as the basic permeable cryoprotectants due to their decreased glass-formation characteristics compared to other cryoprotectants. In the present study, the effects of two different vitrification methods on whole mouse ovarian tissue by the use of a novel staining method (trypan blue) has been evaluated. Methods: Ovaries of 8 day-old NMRI mice were isolated and divided among the control, vitrification 1 (Vit1) and vitrification 2 (Vit2) groups. The Vit1 solution was composed of ?-MEM+ 20% FBS + 15% EG + 15% DMSO. The Vit 2 solution was composed of ?-MEM+ 15% FBS +20% EG + 20% PROH. Vit1 and Vit2 procedures were performed at 4?C and room temperature, respectively. Warming was performed in ?-MEM+ 20% FBS supplemented with 1M sucrose in the Vit1 group and ?-MEM+ 15% FBS with descending concentrations of sucrose (1, 0.5, 0.25 M) in the Vit2 group. Control and vitrified warmed ovaries were put in ?-MEM supplemented by 0.4% trypan blue for 20 min, and then stained ovaries were fixed in Bouin’s fixative, serially sectioned in paraffin wax and finally quantitatively evaluated under a light microscope. Results: The highest percentage of primordial follicles was observed in the control group. There was a significant difference between the control and Vit1 groups, and between the Vit1 and Vit2 groups (p < 0.05). No significant difference was observed in primary and preantral follicles between the control and vitrification groups. Conclusion: Vitrification with EG and PROH are more suitable for preservation of follicle reserves in ovaries. Trypan blue staining is a faster and easier method for evaluation of ovarian tissue.