كلونينگ، بيان ژن وتخليص آنزيم CEL I اندونوكلئاز از گياه كرفس

Cloning, Expression and Purification CEL I Endonuclease Enzyme from Celery Plants

اهداف: آنزيم I CEL يك گليكوپروتئين گياهي است كه از گياهان دسته كرفس استخراج مي شود و اولين آنزيم يوكاريوتي است كه پيوند ناجور را با يك اختصاصيت بالا در يكي از دو رشته DNA برش مي دهد. هدف از اين پژوهش كلون كردن ژن، بيان و تخليص آنزيم CEL I اندونوكلئاز و بررسي عملكرد آن بر روي ژنهاي جهش يافته در محيط آزمايشگاهي بوده است. مواد و روش ها: در اين تحقيق از گياه كرفس mRNA استخراج شد و سپس RT-PCR صورت گرفت و محصول به عنوان الگودر تكثير PCR مورد استفاده قرار گرفت. ژن در پلاسميد بياني pET32a ساب كلون شد و درون باكتري E.coli سويه BL2I( DE3) plysS ترانسفورم گرديد. پروموتور ژن با IPTG القا شد و با وسترن بلاتينگ مورد بررسي قرار گرفت. پروتئين با ستون كروماتوگرافي تمايلي ( S.Tag / His.Tag ) تخليص شد. همچنين فعاليت اندونوكلئازي آنزيم روي محصول PCR ژن جهش يافته و نرمال در حال بررسي مي باشد. يافته ها: كلونينگ ژن با موفقيت انجام شد، پروتئين نوتركيب تخليص شد و نتايج اوليه نشان دادند كه آنزيم مي تواند نواحي هترودوبلكس ژن را شناسايي كند. نتيجه گيري: آنزيم CEL I نوتركيب مي تواند نواحي هترودوبلكس را شناسايي نمايد.

Aims . CEL I, is isolated from celery and the first eukaryotic nuclease is known to have cleavage DNA with high specificity at sites of the two DNA strands in a heteroduplex DNA molecule . The aim of this study was cloning, expression and purification CEL I endonuclease and a simple method for the detection of mutation s. Material & Methods . CEL I mRNA was used for RT-PCR. CEL I cDNA was synthesized and cloned into T-vector pTZ57R, then CEL I subcloned into pET32a expression vector. Recombinant plasmid was transformed into BL2I bacterial cells. Expression of recombinant plasmid was analyzed by western blot technique. Protein was purified by affinity chromatography . In first study, Recombinant enzyme was active in mutation detection in Product PCR normal and mutant BRCA1 gene. Results. The recombinant ( pET32a /CEL I) was successfully expressed in BL2I cells. Western blot analysis showed that the successfully expressed CEL I in the cells transfected . The first study showed that recombinant enzyme is kno wn to nick mismatch sites of the two DNA strands in a heteroduplex DNA molecule. Conclusion. The expression of CEL I in BL2I cells was strong. In vitro, purification protein was successful. Recombinant nucleases CEL I known to nick mismatch sites in a heteroduplex DNA molecule.